VEGF-C真核表达载体的构建和体外表达

摘要

目的 :构建血管内皮生长因子C(VEGF -C)基因的真核表达载体 ,检测其在真核细胞CHO中的表达。方法 :根据人VEGF -CcDNA的序列 ,设计合成一对特异性引物 ,用RT -PCR法克隆乳腺癌细胞MCF -7VEGF -C基因的cDNA ,回收PCR产物连接于克隆载体。扩增 ,质粒提取 ,酶切鉴定并进行基因序列鉴定。酶切回收VEGF -CcDNA全长的基因片段 ,与真核表达载体pcDNA3.1(- )连接称重组质粒进行酶切鉴定。采用脂质体转染法将构建的pcDNA3.1(- ) /VEGF -C转染至CHO细胞中 ,G4 18加压筛选培养。最后用Western -blotting法检测细胞培养上清以及裂解细胞中的VEGF -C蛋白。结果 :基因测序证实RT -PCR产物包含VEGF -CcDNA全长。重组pcDNA3.1(- )中含有VEGF -CcDNA全长序列 ,Western -blotting检测到细胞培养上清中以及细胞内有VEGF -C蛋白存在。结论 :成功构建了人类VEGF