Tims家族蛋白和Tim-3-Galectin-9信号通路在血吸虫感染小鼠Th1/Th2细胞免疫偏移中的作用

摘要

目的:
　　血吸虫病目前仍然是世界上影响范围最广、危害最大的寄生虫病之一,主要在发展中国家和经济落后的地区流行。该病最严重的后果是针对血吸虫虫卵引起的免疫变异反应,而其发病机制尚不完全清楚。本文旨在研究新近发现的蛋白基因家族和分子通路在血吸虫病发生发展中的作用以及对日本血吸虫感染宿主后体内免疫偏移(immune deviation)的影响及其与感染过程中免疫调节的关系。
　　方法:
　　血吸虫病虫卵肉芽肿和肝脏纤维化小鼠模型建立后,按实验要求取各实验组小鼠肝脏制成石蜡切片,用HE染色方法观察不同感染阶段肝脏组织病理变化和免疫组化染色方法观察Tims蛋白的表达情况。
　　分别取各实验组感染小鼠和正常对照小鼠脾脏淋巴细胞培养,收集上清采用ELISA方法检测细胞因子IFN-γ和 IL-4的表达量;部分细胞以RT-PCR半定量方法检测Tims蛋白在各感染阶段的表达量,再分别与细胞因子检测结果进行相关性分析。
　　部分细胞与PBS/Tim-3融合蛋白孵育后进行荧光染色,用流式细胞分选术(Fluorescence-activated cell sorting,FACS)检测T细胞亚群及其Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4的表达,进一步观察小鼠体内Th1/Th2免疫偏移和Tim-3-Galectin-9信号通路对于血吸虫感染后宿主体内免疫调节的作用。
　　取正常对照小鼠脾脏淋巴细胞,分别用不同抗原蛋白刺激培养后再与Galectin-9蛋白共孵育,收集细胞以Annexin V-FITC试剂盒染色,分别用FACS和荧光显微镜检测细胞凋亡情况;收集细胞上清用ELISA法检测IFN-γ,IL-4的表达情况,从而观察体外实验中Tim-3-Galectin-9信号通路对Th1细胞的促凋亡作用和对Th1型免疫反应的负性调节作用。
　　结果:
　　在感染各个阶段,ELISA方法检测IL-4的表达与RT-PCR半定量检测的Tim-2成负性相关,而IFN-γ的表达与Tim-3则无明显相关性;感染后期(9w)HE染色和免疫组化结果可看出肝组织肉芽肿出现逐渐纤维化的情况,Tims蛋白在虫卵表面和内部深染,而同期的Tims蛋白含量在逐渐升高;荧光抗体染色后用FACS检测得出各个感染阶段的Th1和Th2细胞亚群的比例和细胞因子的含量,结果发现以Tim-3-Fc刺激后,CD4+T细胞中Th1细胞比例明显升高;体外细胞凋亡实验中,FACS和荧光显微镜结果都显示出,Tim-3与Galectin-9结合后会促进Th1细胞的凋亡以及IFN-γ表达的减少,而对于Th2细胞以及Th2型细胞因子的影响并不十分明显。
　　结论:
　　本研究构建了血吸虫病虫卵肉芽肿和肝脏纤维化小鼠模型,并观察到在血吸虫感染过程中,Tims蛋白在宿主和血吸虫卵及毛蚴中都有表达,提示该蛋白家族可能在血吸虫与人类具有高度的同源基因;研究结果表明,血吸虫感染后逐渐偏离为Th2细胞介导的优势应答,其机制可能与Tim-3-Galectin-9信号通路介导的促Th1细胞凋亡有关,从而使得Th1型细胞因子的分泌减少,Th1型免疫应答受到抑制;体外实验证实,用Tim-3-Fc间接抑制Tim-3-Galectin-9通路后,Th1细胞明显增殖而使得Th2免疫极化受到一定的影响。
　　Tim-3-Galectin-9信号通路介导的Th1细胞凋亡可能是血吸虫诱导Th2免疫偏移的重要机制,这一发现对于蠕虫感染诱导的免疫负向调控以及慢性血吸虫病肝纤维化发生机制和防治,具有重要的理论和实际意义。

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Tims家族蛋白和Tim-3-Galectin-9信号通路在血吸虫感染小鼠 Th1/Th2细胞免疫偏移中的作用

1.前言

2.材料与方法

2.1 实验材料

2.2实验方法

3.实验结果

3.1 感染小鼠的病理学检查和寄生虫学检查结果

3.2 Tims蛋白和细胞因子（IFN-γ, IL-4）在血吸虫感染后宿主体内的表达

3.3 ELISA 方法检测各感染阶段体内细胞因子的表达

3.4 在各感染阶段Tims蛋白与细胞因子的表达相关性

3.5 Apoptosis检测Tim-3-Galectin-9信号通路对Th1的影响

3.6 FACS检测Tim-3-Galectin-9信号通路对Th1/Th2免疫偏移的影响

4.讨论

4.1 Tims蛋白的表达以及与血吸虫感染的关系

4.2 Tim-3-Galectin-9信号通路对Th1细胞的促凋亡作用

4.3 Tim-3-Galectin-9信号通路对Th1/Th2免疫极化的影响

5.结论

参考文献

附录一

附录二

致谢

附录三（综述）