新型肝癌免疫毒素的构建表达与活性鉴定

摘要

原发性肝癌在世界范围分布较广泛，是严重影响我国人民健康的疾病之一。随着现代医学影像技术的发展，肝癌的诊断率和准确性大幅度地提高了，但是包括基因工程技术在内的现代分子生物学技术的发展在肝癌临床治疗中的应用和对预后的提高上几乎是微乎其微，传统的肿瘤治疗方法在肝癌的治疗中仍占据绝对主导地位。随着肝脏外科技术的改进，肝癌的手术切除率和治疗效果也不断提高，手术死亡率随之降低，但手术治疗也有其特有的局限性，尤其在肝癌的中晚期病人中，往往已不能采取手术治疗的方法。另外常规的放射治疗和化学治疗等方法也存在种种不足和缺陷，如肿瘤的耐药性以及严重的副作用。因此研究肝癌的诊断与治疗新方法具有十分重要的理论与现实意义。 免疫毒素是近年来新兴的一种肿瘤导向治疗方法。它利用抗肿瘤单抗与肿瘤细胞的特异性结合，将生物毒素与抗体偶联，定向攻击肿瘤细胞，而对正常组织的杀伤较小，故被形象地称为“生物导弹”。免疫毒素的细胞毒作用主要源于各种生物毒素，它们的生物活性较高、毒性较大。我们采用的毒素是改造过的绿脓杆菌外毒素PE40KDEL，即去除原毒素中的细胞非特异性结合域并进行了氨基酸突变以增加其细胞毒性，使获得的毒素蛋白在丧失了非特异性细胞毒性的同时增加了对靶细胞的毒性，因而具有很高的应用价值。目前，免疫毒素已在乳腺癌、黑色素瘤、白血病治疗和体外骨髓移植等方面获得了一定的进展，有不少制剂也进入临床Ⅰ/Ⅱ期试验阶段。但由抗体介导的免疫毒素在体内的应用还没有人们预期的那么有效，其原因主要在于：一，鼠源性抗体进入人后会产生人抗鼠的抗体(HAMA)，引起人体过敏反应；二，抗体分子量大，在体内组织的穿透能力差；三，目前多数的小分子抗体自身的亲和力较低，特异性不高；四，肿瘤自身抗原表达的不均一性及抗原的调变，可以逃避偶联药物与之的结合，从而影响治疗效果。随着小分子多肽研究的进一步深入，尤其是随着噬菌体肽库技术的发展，小分子导向载体的发现和应用为导向治疗提供了新途径。 本课题拟从噬菌体展示肽库中筛选能与肝癌细胞发生特异性结合的噬菌体肽(称为肝癌特异性结合肽，livercanceradhesionpeptide，LAP)，并与改造过的绿脓杆菌外毒素PE40KDEL进行基因重组，旨在得到特异性高，杀伤力强的新型免疫毒素。该免疫毒素与目前以抗体为导向的免疫毒素相比，具有分子量较小、免疫原性相对较低、特异性高等优点，理论上可以有效提高定向传递治疗药物的能力。而噬菌体肽库技术用于筛选组织特异性结合肽，其最大优点就是无需知道蛋白质的任何性质，就可筛选得到特异性的结合肽。本文采用的体内筛选方法，可以最大限度地维持肝癌细胞在体内的自然状态，另外噬菌体肽库进入动物体内循环，通过各种正常组织的吸收可以尽量去除非特异性结合的噬菌体肽，起到了理想的反向吸收作用。同时肿瘤组织中特殊的构成结构也为筛选提供了更为丰富的靶目标。特异性结合肽分子量小，免疫原性低，具有很好的生物相容性，具有替代单克隆抗体的潜力，有望在肿瘤的靶向治疗领域发挥更大的作用。 采用基因工程技术，利用噬菌体展示技术筛选到的肝癌特异性结合肽A54，A22，B3，C1(根据特异性结合系数的大小为选择依据，C1作为阴性对照)与PE40KDEL进行基因重组，构建了两种形式的免疫毒素原核表达载体；并探讨了这些载体在大肠杆菌中诱导表达的形式及表达条件；通过几种纯化方法得到了免疫毒素，并初步研究了这些免疫毒素对人肝癌细胞株BEL-7402，BEL-7404，SMMC-7721的生长抑制作用。制备出了特异性的新型肝癌免疫毒素，为今后肝癌的临床导向治疗研究打下基础。实验方法和结果如下： 本课题构建了两种形式的免疫毒素原核表达载体。第一种形式是为了最大限度地保持结合肽在原噬菌体上原有的天然构像和功能，在采用PCR方法扩增肝癌特异性结合肽A54，A22，B3，C1基因片段的同时，保留了噬菌体P3蛋白上与多肽连接的部分序列。并在基因两端加上所需的酶切位点与基因PE40KDEL连接，构建原核表达载体LAP(P3)-PE40KDEL-pLY5。第二种形成是通过化学合成的方法合成了A54基因，构建了A54-PE40KDEL-pET32a(+)表达载体，以获得可溶性表达的免疫毒素。这两种形式构建的免疫毒素原核表达载体，通过基因测序证实无突变，pLY5表达载体转化感受态细胞DH5α，温度诱导后，成功表达了预期的融合蛋白，分子量为55kD，且最大表达量达到细菌总蛋白的18～24％，表达产物主要以包涵体形式存在，经变性，复性，重折叠，初步纯化后得到LAP(P3)-PE40KDEL肝癌免疫毒素。pET32a(+)表达载体转化感受态细胞BL21，受IPTG诱导之后，成功表达了预期的硫氧还蛋白融合蛋白，分子量为58kD，最大表达量占细菌总蛋白的12～15％，表达产物主要以可溶形式存在。融合蛋白经金属镍离子螯合亲和层析纯化，肠激酶酶切，进一步纯化后得到A54-PE40KDEL肝癌免疫毒素，分子量为41kD，纯度达到实验要求。 为进一步研究肝癌免疫毒素的活性，了解其对人肝癌细胞株BEL-7402、SMMC-7721、BEL-7404，人结肠癌细胞HCT-8及RKO，人黑色素瘤细胞A375，正常人肝细胞HL-7702等的生长抑制作用。本课题采用MTT法测定了不同浓度下免疫毒素对以上细胞的作用效果。实验结果显示：(1)A54(P3)-PE40KDEL、A22(P3)-PE40KDEL、B3(P3)-PE40KDEL对BEL-7404有明显的杀伤作用，在统计学上有显著意义，其中A54(P3)-PE40KDEL的杀伤作用最强(IC50=33.5μg/ml)，B3(P3)-PE40KDEL其次(IC50=41.0μg/ml)，A22(P3)-PE40KDEL第三(IC50=56.2μg/ml)，较上述免疫毒素而言，C1(P3)-PE40KDE对BEL-7404无明显杀伤作用(IC50＞100μg/ml)；(2)B3(P3)-PE40KDEL对多种细胞毒性显示，其对人肝癌细胞株BEL-7402、SMMC-7721、BEL-7404杀伤作用明显，同样浓度的免疫毒素对人结肠癌细胞HCT-8及RKO，人黑色素瘤细胞A375的杀伤作用相对较弱，细胞毒性具有统计学显著意义；(3)A54-PE40KDEL对以上几种细胞的毒性作用呈现与B3(P3)-PE40KDEL的毒性作用相近的趋势；(4)A54(P3)-PE40KDEL与A54-PE40KDEL对BEL-7402的IC50分别为25.51μg/ml和18.95μg/ml，两者的细胞毒活性在统计学上有显著意义；(5)以上各免疫毒素对正常肝细胞HL-7702具明显杀伤，该杀伤性不因导向分子差异而不同。 实验研究结论：(1)成功构建了肝癌特异性结合肽融合改构型绿脓杆菌外毒素PE40KDEL的表达载体；(2)完成了载体的诱导表达，并纯化了表达产物；(3)新型免疫毒素对人肝癌细胞株BEL-7402、SMMC-7721、BEL-7404具有较强的生长抑制作用。通过基因工程重组技术，可以大量表达并纯化具有生物活性的特异性免疫毒素，为进一步肝癌的导向治疗研究提供了一条可行的途径。