新型肝癌免疫毒素A54-PE40KDEL的构建表达与活性鉴定

摘要

目的:构建新型肝癌免疫毒素A54-PE40KDEL的原核表达载体,诱导表达后检测其生物活性.方法:PCR扩增绿脓杆菌外毒素A PE40KDEL基因插入到pET32a(+),然后与合成的含有肠激酶酶切位点和肝癌特异性结合肽A54的核酸序列连接,构建重组表达载体pET32a(+)-A54-PE40KDEL,其经鉴定后转化E.coli BL21 表达.超声破菌,上清液经Ni+亲和层析纯化,肠激酶酶切,再次Ni+离子亲和层析后得到免疫毒素A54-PE40KDEL.MTT和间接免疫荧光技术检测其对不同细胞株的细胞毒性及靶向性.结果:重组质粒序列正确,经Western blot证实表达产物含Mr约58 000的目的蛋白.A54-PE40KDEL能够与肝癌细胞特异性结合,且对肝癌细胞的毒性作用与对照相比有极显著性差异(P＜0.01).结论:成功构建了A54-PE40KDEL原核表达载体;获得的新型肝癌免疫毒素A54-PE40KDEL在体外与肝癌细胞具有一定结合特异性及杀伤活性,为肝癌导向治疗提供了一条可行的途径.