PXR受体激动剂高通量筛选模型的优化和天然活性成分的筛选

摘要

目的:利用本实验室前期构建完成的PXR-CYP3A稳定转染HepG2工程细胞株对中药单体成分进行高通量筛选,希望找到对PXR有激活作用的单体成分。首先对稳定转染细胞株的稳定性和细胞培养的基本条件进行了优化,随后对“诸参辛芍叛藜芦”的各单味药水煎液和部分单体成分对该工程细胞株CYP3A4的诱导情况进行检测,考察30种单体成分的PXR激活及CYP3A诱导能力，试图从CYP3A角度解释“诸参辛芍叛藜芦”相反作用机制；接着对本实验保存的118种中药单体进行了PXR激活及CYP3A诱导情况筛选，最后对筛选所得诱导作用较强的单体成分五味子甲素用于石胆酸引起的肝损伤的保护作用进行了整体动物实验研究。
　　方法:利用稳定转染工程细胞株作为筛选模型并结合报告基因技术对天然产物水提物和118种单体成分进行PXR激活特性高通量筛选;利用过量石胆酸造成小鼠肝脏损伤的模型,考察了五味子甲素对PXR调控胆汁酸代谢相关靶基因表达影响及肝脏损伤的保护作用进行了考察。
　　结果:通过条件优化得到的最佳筛选条件是:细胞铺板密度为10×104,血清使用活性炭吸附胎牛血清(FBS),药物最佳处理时间为48 h,利福平(RIF)有效刺激浓度为5μM;同时在对细胞筛选的稳定性和细胞生长环境变化对筛选信号强度的影响进行了考察:通常情况下由于药物加入导致细胞培养液pH值改变未对Gaussia荧光素酶稳定性产生明显影响,但是细胞生长会受到抑制;同时在高浓度DMSO条件下,细胞状态和荧光素酶分泌均保持稳定。利用该细胞筛选模型结合优化的条件,对“诸参辛芍叛藜芦”中各单味药水煎液和单体成分激活PXR和诱导CYP3A4进行了筛选:结果显示人参水提物浓度在大于50 mg/ml、北沙参和白芍水提物在5-100 mg/ml条件下与MEM组比较都对报告基因信号具有抑制作用;而人参水提物在浓度为小于25 mg/ml、南沙参水提物在浓度为50 mg/ml、细辛水提物在浓度为10 mg/ml的时候表现出较强激活效应。藜芦1.25 mg/ml是细胞最适培养浓度,通过观察细胞生长情况,发现藜芦组细胞生长缓慢,有细胞大量死亡情况出现,显示出较强的细胞毒作用。在对各单味药水提物筛选有明显的激活效应或抑制效应的基础上,对各单味药所含的一些单体成分进行了筛选,希望找到水提物中真正起作用的单体成分,利用本实验室保存的人参、党参、丹参等的主要成分标准品进行筛选,结果显示人参的主要皂苷类成分荧光素酶报告基因的诱导倍数均低于RIF处理组,其中人参三醇、人参皂苷Rf、20(S)-人参皂苷Rg2、人参皂苷Rg1、人参皂苷 Rb有潜在的拮抗 PXR抑制 CYP3A特性。20(S)-原人参三醇,20(S)-人参皂苷 F2呈现 PXR激活特性,其诱导倍数高于 DMSO组。芝麻素、丹参素钠、原儿茶酸的诱导倍数低于DMSO,丹参酮IIA(24 h)、丹参酮IIA磺酸钠(48 h)、熊果酸(24 h,48 h)诱导能力强于DMSO,显示出中等强度的PXR激活效应。对本实验保存的其他118种中药单体进行了高通量筛选,其中萝巴新、百秋李醇、五味子甲素等化合物能不同程度地激活PXR,具有潜在的酶诱导效应;化合物黄芩苷、人参皂苷Rg1、氧化苦参碱、人参皂苷Rb等化合物在10μM条件下不同程度抑制PXR活性。整体动物实验的结果显示,五味子甲素各剂量组能有效逆转LCA所致肝损伤小鼠外周血ALT及AST的升高,组织学检查发现,小鼠在给予五味子甲素后,肝细胞的坏死程度得到明显改善,而五味子甲素对LCA所致小鼠肝损伤的保护作用可能与其调控LCA合成及代谢的关键基因SHP,CYP7A1及CYP3A11的表达有关。
　　结论:通过基于PXR-CYP3A通路的细胞筛选实验,发现中药方剂配伍规律和配伍禁忌可能与其所含其单体成分对药物代谢酶CYP3A4诱导或抑制密切相关:人参配伍藜芦相反主要是由于在配伍合用时,随着人参用药浓度的增加,人参皂苷类成分溶出增多,而皂苷类成分主要呈拮抗PXR抑制CYP3A表达的能力,其结果是导致机体对藜芦主要毒性成分藜芦定碱、介芬胺等生物碱的代谢受到抑制。在四物汤中白芍的“反佐作用”也可能与白芍能抑制CYP3A表达相关。通过对单体成分的筛选实验发现了一系列具有潜在诱导或抑制能力的化合物,对深入研究诱导或抑制CYP3A的药理学意义,发现可能的药物相互作用和治疗肝脏相关疾病的化合物提供了很好的线索。利用过量石胆酸造成的肝损伤模型对筛选得到天然产物五味子甲素对小鼠CYP3A诱导能力与加速胆汁酸代谢和保护肝脏作用进行了初步探索,为寻找胆汁酸淤积造成的肝损伤相关药物研究提供了很好的工作基础。

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第一部分基于PXR-CYP3A通路的HepG2工程细胞株稳定性考察和培养条件优化

1.引言

2.材料和方法

3.实验结果

4.讨论

第二部分基于 PXR-CYP3A4 通路的药物相互作用筛选体系在“诸参辛芍叛藜芦”相反机制研究中应用

1.引言

2材料和方法

3.结 果

4.讨论

第三部分利用PXR受体激动剂高通量筛选模型进行天然活性成分筛选

1.引言

2.材料和方法

3.实验结果

4.讨 论

第四部分五味子甲素对石胆酸所致小鼠胆汁酸淤积性肝损伤的保护作用及机制探索

1.引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

个人简历

研究成果

致谢

综述