干细胞微环境对小鼠卵母细胞体外成熟、胚胎发育的影响及其生物活性因子分析

摘要

研究背景:
　　近三十年来,辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)的发展迅速。据统计,在西方国家大约有近1％的儿童的出生有赖于ART技术的运用。目前临床常用的ART方法有:体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)、卵泡浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)、胚胎植入前遗传学诊断(PGD)、赠卵IVF-ET以及配子和胚胎冷冻技术等。ART中所需的卵母细胞大多数是通过对患者行控制性超排卵获得,在一定程度上提高了ART的妊娠率。但控制性超排卵也存在一些弊端及并发症,如卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS)、乳腺癌、卵巢癌发病的潜在危险、医疗费用高、就医时间长等。因此,临床上急需一种新的获取成熟卵母细胞的方法。
　　未成熟卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)即模拟卵母细胞成熟体内环境,使从卵巢采集的未成熟卵母细胞在体外适宜培养条件下达到最后成熟并具有受精能力,成为解决这些问题的有效途径。未成熟卵IVM技术培养出大量成熟的卵母细胞用于体外受精,支持移植前胚胎的发育,在ART中发挥重要的作用。但IVM技术仍然存在一些弊端,究其原因还是由于尚未建立理想的培养体系。目前体外成熟体系中所用的培养液是向基础培养基中添加血清、白蛋白、各种细胞因子和激素等,在一定程度上提高了体外成熟的效率。但仍然存在卵母细胞成熟率低、核质成熟不同步和卵母细胞质量差等不足,所以必须优化培养体系。
　　骨髓间充质干细胞是一种成体干细胞,存在于动物的骨髓腔中,不仅具有自我更新和多向分化功能,而且可以分泌多种细胞因子,如表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、胰岛素样生长因子(Insulinlike growth factors,IGF)、白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)、转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor,FGF)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)等。在卵泡生长发育过程中,颗粒细胞、卵泡膜细胞、卵母细胞以及基质细胞也可以分泌这一系列细胞因子,促进和调节卵母细胞的分化、发育和成熟过程。本课题组前期的研究表明,MSCs条件培养液能够促进小鼠卵巢组织中卵母细胞发育、成熟及胚胎的发育。因此,MSC微环境可能是一种较理想的IVM体系,能模拟卵母细胞细胞成熟的体内微环境,从而使卵母细胞具有良好的发育潜能,提高受精率和胚胎发育能力。本研究拟进一步评价MSCs条件培养液促进小鼠未成熟卵母细胞成熟、胚胎发育的作用,并分析其中生物活性因子,为完善IVM培养体系提供依据。
　　目的:
　　探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)条件培养液(CM)对小鼠未成熟卵母细胞体外成熟作用,对IVF后的胚胎发育的影响,及其发挥作用的机制,为优化IVM培养体系提供依据。
　　方法:
　　1)分离、培养小鼠MSCs,获得MSCs条件培养液。
　　2)收集3类生发泡(GV)期卵母细胞,分别在对照培养基(DMEM、Stempro)和条件培养液(DCM、SCM)中培养,观察卵母细胞成熟率,判断最佳时间点。
　　3)FDA、Hoechst33342和PI联合染色评价卵母细胞细胞的活力。
　　4)荧光标记检测皮质颗粒分布、迁移及纺锤体复合物的形成情况,评价卵母细胞质成熟情况。
　　5)IVM卵母细胞和体内成熟卵母细胞体外受精和胚胎培养,分别计算受精率、4-cell形成率、囊胚形成率,通过形态学观察体外培养胚胎的发育情况。
　　6)囊胚用hoechst33342染色,荧光显微镜下观察囊胚内的内细胞团和滋养层细胞形成情况,计数囊胚内的总细胞数,评价囊胚质量。
　　7)浓缩、收集MSC条件培养液中的蛋白进行电泳,高效液相色谱结合质谱分析鉴定条件培养液中含有的蛋白因子。
　　结果:
　　1)3类卵母细胞在条件培养液中IVM后,其形态学发生了明显的变化,出现核成熟表现。条件培养液组3类生发泡期卵母细胞的成熟率高于对照培养基组;其中,A类(完全∕大部分裸露)生发泡卵母细胞和B类(周围有疏松的颗粒细胞包裹)生发泡卵母细胞的最佳体外成熟时间为16 h,D类(有完整的数层颗粒细胞紧密包裹)生发泡卵母细胞的最佳体外成熟时间为24 h。
　　2)体外成熟卵母细胞活力良好,皮质颗粒分布及纺锤体复合物形成与体内成熟卵母细胞一致,表明胞质已成熟。
　　3)IVM的卵母细胞IVF后胚胎发育良好,受精率、4-cell形成率和囊胚形成率及囊胚内细胞总数与对照组无统计学差异(p>0.05)。IVM组囊胚内细胞染色后的荧光图像与体内成熟组一致。
　　4)通过液质联用分析MSC条件培养液,检出50多种蛋白质,但是在 IVM发挥作用的生物活性因子尚需进一步鉴定。
　　结论:
　　MSCs条件培养液促进IVM小鼠卵母细胞核、质同步成熟,提高胚胎发育的潜能;MSCs培养液含有多种生物活性因子,但在卵母细胞IVM中发挥作用的因子尚需进一步鉴定。

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英文缩略表（abbreviations）

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英文摘要

1 前言

2 材料和方法

2.1材料

2.2 方 法

3 结果

3.1 3类GV期卵母细胞核成熟前后的形态学变化及成熟率观察

3.2 IVM卵母细胞活力检测

3.3皮质颗粒的分布变化

3.4纺锤体复合物的形成

3.5 IVM卵母细胞IVF后胚胎的发育情况

3.6 囊胚期内总细胞数目

3.7 MSCs上清中蛋白液相色谱联合质谱分析

4 讨论

4.1促进卵母细胞核质成熟同步化是IVM培养体系的关键

4.2优质卵母细胞有利于体外受精及胚胎的发育

4.3 MSCs条件培养液促进卵母细胞发育成熟的机制

5 结论

6研究工作的进一步设想

参考文献

附录

致谢

体外成熟的卵母细胞胞质成熟的评价指标