G蛋白偶联受体激酶5在斑马鱼造血系统发育中调节作用的研究

摘要

G蛋白偶联受体(GPCR)是细胞膜表面最大的一类受体超家族,具有七次跨膜螺旋结构,介导多种多样的配体信号,包括神经递质、激素、气味以及其他小分子等,广泛的参与多种生理功能,同时其自身也受到精细的调节,其中重要的一种负反馈调节即为由G蛋白偶联受体激酶(Gprotein coupled receptor kinase,GRK)介导的受体脱敏。目前已发现七种GRK亚型:GRK1-7。其分布、作用底物也不尽相同。　　造血系统的发育维持受到一系列转录因子的调控,GATA家族是其中一类重要的转录因子,GATA2主要分布在造血干细胞和前体细胞中,对造血系统的发育有重要的调节作用。结合本实验室以及最新的的研究报道提示,斑马鱼GRK2/3可通过与PTCH1的相互作用以及磷酸化Smo等途径在胚胎发育过程中发挥着重要调控作用。本研究在以前工作的基础上,以斑马鱼为模型初步探索了G蛋白偶联受体激酶5对造血系统发育的调控作用及其机制。　　本研究结果:　　(1)我们根据斑马鱼基因库中GRK5的同源序列,通过采用提取斑马鱼总RNA,进行RACE-PCR的方法克隆出了斑马鱼的GRK5,并对其序列进行了进化分析。　　(2)采取整体原位杂交的实验方法对GRK5在斑马鱼体内的表达分布情况进行了初步探讨。采用morpholino的方法在斑马鱼中对GRK5进行Knockdown之后,造血系统发育必需的标记基因Fli-1以及Gata1的表达量均有明显下降,这种现象能被外转的GRK5全长蛋白以及激酶活性缺失突变体K215R所逆转。提示GRK5可能参与到造血系统的发育调控。　　(3)通过免疫共沉淀的方法,我们发现GRK5与GATA2存在相互作用,并且GRK5的216位精氨酸在与GATA2发生相互作用中是必需的。　　(4)在过表达GRK5或者对GRK5进行Knockdown之后采用RT-PCR的实验方法验证造血相关GATA2下游基因包括α-globin、γ-globin、MLF1、P27、PU1的表达均发生明显改变。进一步实验发现GRK5与GATA2相互作用功能缺失突变体GRK5-R216L不能逆转由GRK5的Knockdown引起的斑马鱼造血系统发育必需的标记基因的表达异常。　　综上所述,本研究发现：　　(1)GRK5对斑马鱼造血正常发育必需的标记基因Fli-1和Gata-1的正常表达是必需的,提示其可能参与到斑马鱼造血系统发育的调控;　　(2)GRK5通过与GATA2的相互作用来调节GATA2的转录活性并影响GATA2下游基因表达,这为进一步研究GRK5对斑马鱼造血系统发育的调控机制提供了新的思路。