定量蛋白质组学与生物信息学结合研究TLR信号通路以及MyD88的复合物

摘要

天然免疫系统是生物体抵御微生物感染的第一道防线。自从在果蝇里发现Toll样受体在真菌感染下能有效地诱导免疫系统发生反应开始，越来越多的证据表明天然免疫系统能够特异性识别病原菌的入侵。天然免疫系统识别的对象是一类结构保守的病原微生物，即病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)。而天然免疫系统中的受体则称之为模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)。PRRs对PAMPs的特异性识别有效地监测了病原微生物的入侵并且诱导机体产生免疫应答反应。Toll样受体就是一类非常重要的模式识别受体(PRRs)，能识别细菌，真菌，核酸，病毒等等。目前已发现十多种Toll样受体，他们不仅在天然免疫系统中起着关键作用，同时也是连接天然免疫系统和获得性免疫系统的桥梁。对TLR信号通路的研究对免疫学的发展来说是至关重要的，目前对TLR信号通路的研究主要是通过分子生物学在基因层面上进行的。在蛋白层面上，缺乏大规模的研究数据。本论文依托基于质谱的细胞体内稳定同位素标记定量蛋白质组学技术（AACT/SILAC）和生物信息学分析，在蛋白层面上对TLR信号通路及其关键接头蛋白MyD88的复合物进行了全面系统的研究工作。　　论文的第一章介绍了近年来定量蛋白质组学在方法和技术路线上的发展概况，强调了本文所用的氨基酸稳定同位素标记技术(AACT/SILAC)。在此基础上，进一步综述了目前基于质谱技术的蛋白质相互作用的一些传统生物学研究方法以及生物信息学预测分析，并且指出各自的优缺点。由以上这些技术背景介绍引出了本论文的研究背景;并且在最后阐述了本论文的研究目的和意义。论文的研究工作主要分三部分，第一部分主要研究的是LPS短时间刺激下巨噬细胞亚细胞组分的TLR4信号通路变化;第二部分主要是初步探索LPS以及Zymosan刺激巨噬细胞时TLRs受体的主要接头蛋白内源性MyD88的蛋白复合物情况;第三部分主要是改进了第二部分的免疫沉淀方法并结合蛋白结构域的信息来研究LPS刺激时内源性MyD88复合物的变化。下面将详细介绍各章内容:　　（一）亚细胞定量蛋白组学和生物信息学解析LPS短时刺激下引起的巨噬细胞内TLR4信号通路的变化　　脂多糖LPS是革兰氏阴性菌细胞壁内毒素的主要成分，LPS作为一个主要的促炎症因子，以污染的形式广泛存在于空气颗粒中包括大气污染、有机粉尘、香烟雾等地方。作为天然免疫系统的第一道防线，Toll样受体4(TLR4)能够特异性的识别脂多糖并且激活调节一系列的信号转导以此来激活受感染宿主的免疫炎症反应。对于TLR4通路的研究中，尽管已经有大量参与到该通路的基因和蛋白的功能得到了验证，但是大部分研究都是通过传统生物学手段以单个基因或蛋白为研究对象来进行的。目前为止对由LPS所诱导的TLR4信号通路的整个调控机制及网络仍然缺乏大规模系统性的研究，可以说现在所得到的TLR4信号通路仍然是很不完整的，还有很多未知的东西可以探索。　　通过之前的一些研究成果，我们发现大部分信号通路都在脂多糖(LPS)感染宿主的初期阶段就被激活。因此，我们选择了细胞体内稳定同位素标记的这一强大的定量蛋白质组学技术来对活体巨噬细胞受到LPS感染后，蛋白在细胞核和细胞质内的差异表达情况进行系统的研究。通过对细胞器的分离（细胞核与细胞质）不仅可以有效降低样品分离的复杂性，提高了质谱对样品的鉴定能力，并且可以发现某些有意义的低丰度信号蛋白在特定细胞器中得到了富集，从而使我们更好的了解宿主受感染后它们是如何发挥作用的。通过这一亚细胞定量蛋白组学的方法，在细胞受到LPS刺激10分钟后，在细胞质中鉴定到508个蛋白发生了上调，103个蛋白发生了下调;与此同时，在细胞核中鉴定到678个上调蛋白，80个下调蛋白。我们对鉴定到的两部分蛋白进行了基本的生物信息学功能分析，发现在S1胞质部分，差异表达的蛋白主要参与了蛋白代谢，蛋白修饰，细胞周期，凋亡等生物学过程;而S3核部分蛋白更多的参与了RNA剪接、DNA/RNA代谢、转录等生物学过程，这与我们采取核与胞质和核的亚细胞分离手段的预期结果一致。　　同时，我们还发现许多关键的涉及MAPK通路和NF-κB通路的信号蛋白是在细胞质中被激活，而各类重要的转录因子比如干扰素调节因子(IRFs)则在细胞核中被激活。通过生物信息学的分析，我们构建了各个被激活信号通路的串联网络图并将这一网络图延伸到了细胞凋亡的调控中。更为重要的是，借助生物信息学分析，我们第一次在蛋白层面上全面系统的认识到了这些上游激活的信号通路是如何相互串联来调节激活下游的转录因子的。而激活的转录因子又调控了一系列促炎症因子的表达从而参与到多种生物学过程包括蛋白和核酸代谢，DNA损伤修复，细胞周期调控以及宿主防御等等。对TLR4通路的全面解析对相关的免疫性疾病的诊断、治疗、预防等具有重要的指导意义。　　（二）结合传统免疫共沉淀及AACT技术初步探索TLR2、TLR4信号通路中内源性MyD88的复合物　　目前已经发现13个TLR家族，虽然不同的TLR所识别的PAMPs不同，但髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)是除了TLR3以外所有TLR家族路中关键的接头分子，是信号向下游转导的关键靶蛋白。MyD88可以通过其死亡结构域(Death Domain，DD)募集下游信号分子使信号下传，激活一系列的下游信号通路，这些激活的下游通路又互相关联来控制炎症反应。因此研究MyD88的复合物能使我们更好的了解宿主受到感染时TLRs信号通路的调控机制。　　现在已经发展很多与质谱技术相结合的方法用于大规模研究蛋白相互作用，比如串联亲和纯化（TAP技术）以及体内双标签技术等，但是这些技术都会涉及到在细胞内构建标签蛋白，这就在一定程度上改变了细胞的生理环境以及蛋白特性。而且内源性靶蛋白可能与标签蛋白产生竞争作用。因此研究蛋白相互作用最理想的方法是用免疫共沉淀的方法直接把内源性的靶蛋白复合物pull down下来。然而传统免疫沉淀的缺点在于背景高，沉淀下的复合物很可能是假阳性的。这里我们将AACT/SILAC技术与传统免疫沉淀相结合，很好的弥补了免疫沉淀的这个缺陷，通过质谱鉴定后的定量信息筛选出特异性相互作用的蛋白复合物。　　这里我们使用TLR4受体的配体LPS以及TLR2受体的配体Zymosan刺激巨噬细胞，结合上述方法鉴定挑选出了82个受LPS刺激后以及56个受Zymosan刺激后与内源性MyD88相互作用增强的蛋白复合物。并通过生物信息学对它们进行了初步功能分析。表明了MyD88及其复合物在调控TLR4以及TLR2通路上的异同点。　　（三）基于AACT的磁珠免疫共沉淀和蛋白结构域信息鉴定和分析LPS刺激下RAW264.7细胞中内源性MyD88的复合物　　传统琼脂糖免疫共沉淀的方法虽然能研究生理条件下的蛋白复合物，但是由于步骤太多，容易产生误差，损失弱相互作用蛋白。这里我们利用商品化的磁珠protein A beads取代传统琼脂糖protein A beads，大大简化了实验步骤，减少了细胞用量。我们将这一改进的免疫共沉淀与AACT/SILAC技术相结合，鉴定筛选出了161个在LPS刺激后与内源性MyD88相互作用增强的蛋白。　　生物信息学在蛋白相互作用中的预测和验证中起到了重要作用。蛋白相互作用通常不需要蛋白全长的参与，而是通过蛋白质结构域来完成的。一些数据库通过对以往所得蛋白相互作用数据的研究而归纳总结出结构域相互作用的规律，这些规律可以被用来旁证新得到的相互作用蛋白的可信度。　　这里我们应用蛋白结构域聚类的方法对我们所得到的数据进行分析，发现我们所得到的数据有结构域聚类的现象，含有这些结构域的蛋白会涉及多个生理学过程，说明MyD88会募集不同功能的蛋白来共同协调整个TLR信号通路。我们进一步通过对蛋白结构域相互作用的分析，预测了这些蛋白复合物两两之间的相互作用关系，发现MyD88募集的复合物主要可以分为3层，最有可能和MyD88发生直接相互作用的蛋白是第一层相互作用蛋白，这类蛋白主要涉及激酶活性等功能从而很好的激活上游的信号级联通路。通过与第一层相互作用蛋白的连接，第二层相互作用蛋白接收到这些信号，并调动了一系列蛋白来参与涉及多个生理学过程。最后信号传到第三层相互作用蛋白上并激活了一系列核苷酸代谢来进行基因调控表达。这一系列的过程能让我们更好的看到宿主体受感染后的信号从MyD88开始往下传递的整个免疫应答过程。我们的方法同样适用于对其它靶蛋白的复合物的研究。

目录

摘要

第一章 前言

1 定量蛋白质组学

1．1 基于凝胶的定量蛋白质组学

1．2 基于质谱的定量蛋白质组学

2 与质谱相结合的蛋白质相互作用技术

2．1 免疫共沉淀

2．2 化学交联

2．3 生物信息学

3 本论文的选题目的及意义

参考文献

第二章 亚细胞定量蛋白组学和生物信息学解析LPS短时刺激下引起的巨噬细胞内TLR4信号通路的变化

1．引言

2．实验试剂和实验方法

2．1 化学试剂、抗体及仪器

2．2 细胞培养及AACT／SILAC体内标记

2．3 LPS刺激AMJ2细胞的条件摸索

2．4 亚细胞器分离

2．5 切胶酶解

2．6 酶解肽段的液相色谱分离及质谱鉴定

2．7 数据库搜库和蛋白定量分析

2．8 免疫印迹

2．9 基于生物信息学的数据分析

3．结果和讨论

3．1 LPS刺激下巨噬细胞胞质和核内差异蛋白表达的鉴定和分析

3．2 AACT定量的胞质蛋白和核蛋白的功能分类研究

3．3 LPS刺激下TLR4下游信号通路的相互关联

3．4 LPS诱导的巨噬细胞早期免疫应答中的细胞凋亡

3．5 早期免疫应答中的转录调控网络

3．6 基于AACT定量结果的免疫印迹验证

4 结论

参考文献

第三章 结合传统免疫共沉淀及从CT定量蛋白组学技术初步探索TLR2、TLR4信号通路中内源性MyD88的复合物

1．引言

2．实验试剂和实验方法

2．1 化学试剂、抗体及仪器

2．2 细胞培养及AACT／SILAC体内标记

2．3 Zymosan刺激AMJ2细胞的条件摸索

2．4 蛋白提取和MyD88蛋白复合物的纯化

2．5 酶解肽段的液相色谱分离及质谱鉴定

2．6 数据库搜库和蛋白定量分析

2．7 免疫印迹(半干转)

2．9 基于生物信息学的数据分析

3 结果与讨论

3．1 免疫共沉淀小试

3．2 LPS及Zymosan刺激细胞后内源性MyD88复合物的鉴定和定量

3．3 LPS刺激后姆D88复合物的功能分类

3．4 Zymosan刺激后MyD88复合物的功能分类

3．5 LPS及zymosan刺激后MyD88复合物的功能比较

4 结论

参考文献

第四章 基于从CT的磁珠免疫共沉淀和蛋白结构域信息鉴定分析LPS刺激下RAW264．7细胞中内源性MyD88的复合物

1．引言

2．实验试剂和实验方法

2．1 化学试剂、抗体及仪器

2．2 细胞培养及AACT／SILAC体内标记

2．3 LPS刺激RAW 264．7细胞的条件摸索

2．4 蛋白提取和MyD88蛋白复合物的纯化

2．5 酶解肽段的液相色谱分离及质谱鉴定

2．6 数据库搜库和蛋白定量分析

2．7 免疫印迹(湿转)

2．8 基于定量数据的结构域聚类以及结构域相互作用数据分析

3 结果与讨论

3．1 免疫共沉淀小试

3．2 RAW264．7细胞对LPS的响应情况

3．3 结合磁珠免疫共沉淀以及AACT技术对RAW细胞内源性MyD88复合物的鉴定和定量

3．4 基于定量信息和功能结构域的蛋白相互作用聚类分析

3．5 基于结构域相互作用的蛋白相互作用预测

4 结论

参考文献

博士期间发表论文情况

致谢