AO-I阻断人EOC细胞MD2/TLR4复合物介导的PTX/MyD88/NF-κB耐药信号通路

摘要

目的:本研究的目的在于探讨白术内酯Ⅰ(AO-Ⅰ)下调紫杉醇诱导的MyD88+人卵巢癌细胞skov3促炎症细胞因子IL-6、VEGF、Survivin表达的作用机制。
　　方法:1、用流式细胞术检测紫杉醇(PTX)、脂多糖(LPS)、白术内酯Ⅰ(AO-Ⅰ)、AO-Ⅰ联合紫杉醇、AO-Ⅰ联合LPS诱导SKOV3细胞6h后TLR4/MD2二聚体的形成。2、分别用固定浓度白术内酯Ⅰ、不同浓度的紫杉醇(PTX)、固定浓度的白术内酯Ⅰ联合不同浓度紫杉醇诱导人卵巢癌MyD88+ SKOV3细胞24h后，应用蛋白质免疫印迹分别检测蛋白样品中NF-κB P65和磷酸化P65在人卵巢癌细胞SKOV3中的表达。3、分别用固定浓度白术内酯Ⅰ、固定浓度的PTX、固定浓度的LPS、白术内酯Ⅰ联合紫杉醇、白术内酯Ⅰ联合脂多糖诱导人卵巢癌MyD88+ SKOV3细胞和MyD88-A2780细胞6h、12h、24h，应用蛋白质免疫印迹分别检测蛋白样品中NF-KB P65和磷酸化P65在人卵巢癌细胞SKOV3和A2780中的表达。4、用流式细胞术检测PTX、LPS、白术内酯Ⅰ、AO-Ⅰ联合紫杉醇、AO-Ⅰ联合LPS诱导SKOV3/A2780细胞12h、24h后细胞G2/M期时相分布的比例。5、运用统计软件SPSS17.0对数据进行统计学分析。
　　结果:1、流式细胞术检测浓度为2μmol/L、10μmol/L PTX、LPS(1μg/ml)、AO-Ⅰ(100μmol/L)、AO-Ⅰ联合PTX(2μmol/L、10μmol/L)、AO-Ⅰ联合LPS诱导SKOV3细胞6h后TLR4/MD2二聚体形成:与空白组相比，LPS组诱导培养后，二聚体形成量增多，有统计学意义(P＜0.05)，AO-Ⅰ组诱导培养后二聚体形成量减少，有统计学意义(P＜0.05)，PTX组分别以2μmol/L、10μmol/L诱导培养后二聚体形成量增多，有统计学意义(P＜0.05);AO-Ⅰ联合LPS组与单药LPS组相比，二聚体形成量减少，有统计学意义(P＜0.05)，AO-Ⅰ分别与PTX2μmol/L、10μmol/L联合诱导培养后与相应浓度单药PTX组相比，二聚体形成量减少，有统计学意义(P＜0.05)。2、固定浓度AO-Ⅰ100μmol/L诱导培养人卵巢癌MyD88+ SKOV3细胞24h，NF-κBP65磷酸化水平比空白组低，有统计学意义(P＜0.05);不同浓度PTX0.01μmol/L、0.02μmol/L、0.05μmol/L，NF-κB P65磷酸化水平比空白组高，有统计学意义(P＜0.05);白术内酯Ⅰ联合不同浓度紫杉醇，NF-κB P65磷酸化水平与紫杉醇组相比，明显下调。3、固定浓度的AO-Ⅰ100μmol/L、PTX0.01μmol/L、LPS1μg/ml、AO-Ⅰ联合PTX、AO-Ⅰ联合LPS，诱导人卵巢癌MyD88+ SKOV3细胞6h、12h、24h，结果显示:AO-Ⅰ组，NF-κB P65磷酸化水平6h、12h、24h比相应时间点的空白组低，有统计学意义(P＜0.05)。LPS组，NF-κ B P65磷酸化水平6h、12h、24h比相应时间点的空白组高，有统计学意义（P＜0.05）。PTX组， NF-κB P65磷酸化水平6h、12h、24比相应时间点的空白组高，有统计学意义(P＜0.05)。AO-Ⅰ联合LPS组与LPS组比较，NF-κB P65磷酸化水平6h、12h、24h比相应时间点的LPS组低，有统计学意义(P＜0.05)。 AO-Ⅰ联合PTX组与PTX组比较，NF-κ B P65磷酸化水平6h、12h、24h比相应时间点的PTX低，有统计学意义(P＜0.05)。药物诱导人卵巢癌MyD88-A2780细胞6h、12h、24h，结果显示:AO-Ⅰ组、LPS组，NF-κB P65磷酸化水平与空白组相比，无统计学意义(P＞0.05)。PTX组与空白组比较，NF-κB P65磷酸化水平比空白组低，有统计学意义(P＜0.05)。AO-Ⅰ联合LPS组与LPS组比较，NF-κB P65磷酸化水平无统计学意义(P＞0.05)。AO-Ⅰ联合PTX组与PTX组比较， NF-κB P65磷酸化水平无统计学意义(P＞0.05)。4、流式细胞术检测PTX(0.01μmol/L)、LPS（1μg/ml）、AO-Ⅰ(100μmol/L)、AO-Ⅰ联合紫杉醇、AO-Ⅰ联合LPS诱导SKOV3细胞12h、24h后细胞G2/M期时相分布:药物诱导细胞后12h和24h，单药AO-Ⅰ组比空白组G2/M期比例降低，单药PTX组、LPS组比空白组G2/M期比例升高，AO-Ⅰ联合PTX组、AO-Ⅰ联合LPS组分别比单药PTX组、LPS组G2/M期的比例降低;作用12h与作用24h相比，AO-Ⅰ组24h比12h G2/M期的比例降低，PTX组24h比12h G2/M期的比例升高， LPS组24h比12h G2/M期的比例升高， AO-Ⅰ联合LPS组24h比12h G2/M期的比例降低， AO-Ⅰ联合PTX组24h比12h G2/M期的比例降低。说明AO-Ⅰ在SKOV3细胞有阻止PTX/LPS诱导的细胞进入分裂期作用。药物诱导A2780细胞12h、24h后细胞G2/M期时相分布的比例显示:不同的实验组G2/M期时相分布的比例无明显差异(P＞0.05)，相同的实验组不同的时间点无明显差异(P＞0.05)。
　　结论:1、紫杉醇(PTX)2μmol/L、10μmol/L诱导SKOV3细胞6h后能形成TLR4/MD2二聚体，AO-Ⅰ100μmol/L联合紫杉醇组，AO-Ⅰ能下调紫杉醇诱导的TLR4/MD2二聚体形成。2、 AO-Ⅰ能下调TLR4/MyD88+人卵巢癌SKOV3细胞的NF-κB P65磷酸化表达，AO-Ⅰ联合紫杉醇组，AO-Ⅰ能下调紫杉醇诱导的TLR4/MyD88+人卵巢癌SKOV3细胞NF-κB P65磷酸化表达。而AO-Ⅰ不能下调MyD88-卵巢癌A2780细胞NF-κB P65磷酸化表达。3、AO-Ⅰ能阻止MyD88+人卵巢癌SKOV3细胞进入分裂期，增强紫杉醇对卵巢癌细胞有丝分裂的阻止作用。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 方法及技术

3 流式细胞术测TLR4／MD2二聚体形成

结果

1 固定浓度白术内酯Ⅰ、PTX、LPS、固定浓度白术内酯Ⅰ联合PTX、白术内酯Ⅰ联合LPS诱导人卵巢癌细胞6h TLR4／MD2二聚体的形成

2．1 单药白术内酯Ⅰ、不同浓度PTX诱导人卵巢癌SKOV-3细胞24h后NF-κB P65的表达

2．2 固定浓度的白术内酯Ⅰ联合不同浓度PTX诱导人卵巢癌SKOV-3细胞24h后NF-κB P65的表达

2．3 固定浓度白术内酯Ⅰ、PTX、LPS诱导人卵巢癌SKOV-3细胞和A2780细胞6h、12h、24h后NF-κB P65的表达

2．4 固定浓度白术内酯Ⅰ联合PTX、白术内酯Ⅰ联合LPS诱导人卵巢癌细胞6h、12h、24h NF-KB P65的表达

2．5 固定浓度白术内酯Ⅰ、PTX、LPS、固定浓度白术内酯Ⅰ联合PTX、白术内酯Ⅰ联合LPS诱导人卵巢癌SKOV-3细胞和A2780细胞12h细胞周期G2／M期分布

2．6 固定浓度白术内酯Ⅰ、PTX、LPS、固定浓度白术内酯Ⅰ联合PTX、白术内酯Ⅰ联合LPS诱导人卵巢癌细胞24h细胞周期G2／M期分布

讨论

1 TLR-4的生物学特性及紫杉醇耐药机制

2 PTX激活TLR4通过MD2形成TLR4／MD-2二聚体

3 TLR-4／MyD88信号通路

4 NF-κB信号通路

5 TLR-4／MyD88／NF-κB信号通路在卵巢癌中与紫杉醇抵抗的关系

6 AO-Ⅰ通过阻止TLR4／MyD88信号通路增强卵巢癌对紫杉醇的化疗敏感性

结论

问题与展望

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

MyD88+介导卵巢癌紫杉醇抵抗的研究进展 综述

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