内皮祖细胞灌注供心诱导免疫耐受延长同种异体心脏移植物存活时间

摘要

第一部分大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养和鉴定的实验研究 【目的】研究大鼠骨髓内皮祖细胞(EPC)分离、培养并向内皮细胞方向诱导分化的方法和条件。 【方法】获取SD大鼠的骨髓细胞，通过密度梯度离心法分离培养单个核细胞，取贴壁细胞选择性诱导培养2w以上，获取内皮祖细胞(EPC)。以Dil-ac-LDL、FITC-IYEA-1双荧光染色法鉴定EPC。 【结果】贴壁细胞经诱导培养后3d开始伸展，5d形成集落，7-10d增殖加速并出现条索状结构，2w大部分细胞呈多角形。Dil-ac-LDL、FITC-IYEA-1双染，免疫荧光染色阳性率大于70％。 【结论】通过贴壁诱导筛选法培养可以从大鼠骨髓中分离培养出纯度较高的具备内皮细胞部分特征的EPC。 第二部分内皮祖细胞的混合淋巴细胞培养实验 【目的】研究骨髓来源内皮祖细胞在体外培养时对混合淋巴细胞反应的影响【方法】以SD大鼠的脾淋巴细胞为刺激细胞，以Wistar大鼠的脾淋巴细胞为反应细胞，分为5组。组I：为对照组，1x10<'5>个刺激细胞和1x10<'5>个反应细胞共同培养；组II：1x10<'5>个反应细胞与1×10<'4>个SD大鼠的内皮祖细胞共同培养；组III：1x10<'5>个刺激细胞和1x10<'5>个反应细胞并加入1×10<'4>个SD大鼠的内皮祖细胞共同培养；组Ⅳ：1×10<'5>刺激细胞和1x10<'5>反应细胞并加入1×10<'3>个SD大鼠的内皮祖细胞共同培养；组V：1×10<'5>刺激细胞、1 x10<'5>反应细胞、1×10<'4>个SD大鼠的内皮祖细胞和2μg/ml植物刺激素共同培养。混合培养120小时，结束培养前13小时，每孔加入<'3>H-TdR20ul，以液闪测定仪测定各组的CPM值。 【结果】各组的CPM值：组Ⅰ为11970.2±2202.2，组Ⅱ为1279.24±159.8，组Ⅲ为1194.6±362.3，组Ⅳ为1784.44±568.08，组Ⅴ为4839.24±1328.2。组Ⅱ、组Ⅲ、组Ⅳ、组Ⅴ与组Ⅰ相比差异显著(P<0.05)，组Ⅱ、组Ⅲ、组Ⅳ与组Ⅴ相比差异显著(P<0.05)。组Ⅱ、组Ⅲ和组Ⅳ组间差异不显著(P<0.05)。 【结论】内皮祖细胞在体外共培养能抑制混合淋巴细胞反应，具有抑制细胞免疫功能。 第三部分同种异体大鼠异位心脏移植模型的建立 【目的】以改良Ono法进行大鼠腹部心脏移植，建立动物模型。 【方法】以30只体重200～250g的雄性SD大鼠为供体，30只体重200～250g的雌性Wistar大鼠为受体，进行大鼠腹部异位心脏移植手术。SD大鼠经麻醉、肝素化后，打开胸腔，阻断主动脉，经主动脉根部灌注心肌保护液，将供体的心脏取下。Wistar大鼠麻醉后，打开腹腔，将供体的主动脉与受体的腹主动脉行端侧吻合，将供体的肺动脉和受体的下腔静脉行端侧吻合。观察术后供心的生存时间。 【结果】大鼠异位心脏移植模型成功率达90％。术后平均供心存活时间为6.74±1.1d。 【结论】改良Ono法进行大鼠腹部心脏移植模型可靠易行，可重复率高。 第四部分内皮祖细胞灌注供心的安全性评价 【目的】评价同种异体大鼠心脏移植手术中EPC灌注供心的安全性。 【方法】以15只体重200～250g的雄性SD大鼠为供体，15只体重200～250g的雌性Wistar大鼠为受体，分为3组，每组5对。组I：供心移植前经冠脉灌注DAPI染色的1×10<'7>个SD大鼠的骨髓来源的内皮祖细胞(EPC)；组Ⅱ：供心移植前经冠脉灌注DAPI染色的1×10<'6>个SD大鼠的EPC；组Ⅲ：供心移植前经冠脉灌注DAPI染色的1×10<'5>个SD大鼠的EPC。进行异位心脏移植术，观察术中、术后心律失常发生，围手术期心脏停跳、心肌梗死的发生率；术后5天取移植心，通过冰冻切片荧光显微镜观察灌注内皮祖细胞心肌内分布。 【结果】组I术后心律失常发生率60％(3/5)，出现供心早期的停跳40％(2/5)，复旦大学博士论文·2007病理标本发现心肌梗死40％(2/5)，在组Ⅱ和组Ⅲ未见发生，组Ⅰ和组Ⅱ、Ⅲ相比，差异有显著性(P<0.05)。平均荧光细胞计数：组Ⅰ为4.734±0.69个/mm<'2>，组Ⅱ为3.58±0.62个/mm<'2>，组Ⅲ为1.11±0.24个/mm<'2>，组Ⅲ比组Ⅰ、Ⅱ明显减少，差异有显著性(P<0.05)。 【结论】以细胞数量为1×10<'6>个内皮祖细胞灌注供心是安全的。 第五部分内皮祖细胞灌注对同种异体心脏移植供心生存时间的影响 [目的] 研究EPC灌注供心对同种异体心脏移植物生存时间的影响。 [方法] 20只体重200～250g的雄性SD大鼠为供体，20只体重200～250g的雌性Wistar大鼠为受体，分为4组，每组5对。组Ⅰ：为对照组，术后不使用环胞霉素；组Ⅱ：术后7天每天使用环胞霉素5mg/kg；组Ⅲ：术中供心经冠脉灌注内皮祖细胞1×10<'6>个，术后不使用环胞霉素；组Ⅳ：术中供心经冠脉灌注内皮祖细胞1×10<'6>个，术后7天每天使用环胞霉素5mg/kg。观察各组供心存活时间，供心跳动变弱时取出移植物，进行病理检查。 [结果] 各组供心平均存活时间分别为：组Ⅰ为6.24±0.8d，组Ⅱ为11.6±1.1d，组Ⅲ为9.44±1.1d，组Ⅳ为18.8±1.6d。组Ⅱ、组Ⅳ移植物的平均存活时间较组Ⅰ显著延长(P<0.05)。组Ⅳ移植心脏平均存活时间明显长于组Ⅱ和组Ⅲ(P<0.05)。 [结论]内皮祖细胞灌注合并环胞霉素运用可以延长大鼠心脏移植物的存活时间。 第六部分内皮祖细胞灌注对同种异体大鼠心脏移植急性排斥反应的影响 [目的]通过远交系和近交系大鼠异位心脏移植的比较，根据术后近期的脾脏和淋巴结中CD3<'+>、CD4<'+>和CD8<'+>的增生情况，了解同种异体大鼠心脏移植术后T细胞免疫的变化，结合术后的移植心的病理检查研究EPC灌注对心脏移植术后急性排斥反应的影响。 [方法]10只体重200～250g的雌性Wistar大鼠，随机分为供体和受体，共5对，为组Ⅰ(近交系移植组)；另外20只体重200～250g的雄性SD大鼠为供体，20只体重200～250g的雌性Wistar大鼠为受体，分为4组，每组5对：组Ⅱ术后不使用环胞霉素，组Ⅲ术后7天每天使用环胞霉素5mg/kg，组Ⅳ术中供心经冠脉灌注内皮祖细胞1×10<'6>个，组Ⅴ术中供心经冠脉灌注内皮祖细胞1×10<'6>个、术后7天每天使用环胞霉素5mg/Kg。术后七天取供心，观察病理改变，并取脾脏和腹股沟淋巴结通过流式细胞测定CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>的百分比，计算并比较各组CD4<'+>/CD8<'+>的比值。 [结论]内皮祖细胞合并环胞霉素的运用能调节T淋巴细胞CD4/CD8比例，改善急性排斥反应，具有一定的诱导免疫耐受功能。 第七部分供体内皮祖细胞灌注供心对同种异体大鼠心脏移植细胞因子的影响 [目的]通过研究心肌组织的细胞因子的含量变化，探讨供体内皮祖细胞灌注供心改善急性排斥反应的机理。 [方法]以20只体重200～250g的雄性SD大鼠为供体，20只体重200～250g的雌性Wistar大鼠为受体，分为4组，每组5对：组Ⅰ为对照组，术后不使用环胞霉素；组Ⅱ术后7天每天使用环胞霉素5mg/kg；组Ⅲ术中供心经冠脉灌注内皮祖细胞1×10<'6>个；组Ⅳ术中供心经冠脉灌注内皮祖细胞1×10<'6>个，术后7天每天使用环胞霉素5mg/Kg。各组于术后第7天取供心，使用实时定量PCR的方法测定各组移植心INF-γ、IL-2、TNF-α，TGF-β、VEGF、IL-10的含量。 [结果]心肌细胞因子的检查：与组Ⅰ相比，组Ⅱ、组Ⅲ和组Ⅳ的INF-γ、IL-2细胞因子明显降低并有统计学差异(P<0．05)，IL-10改变无统计学差异(P>0.05)，组Ⅱ、组Ⅲ的TGF-β升高有统计学差异(P<0.05)，组Ⅱ、组Ⅲ和组Ⅳ的TNF-α较组Ⅰ明显降低并有统计学差异(P<0.05)；与组Ⅰ相比，组Ⅲ的VEGF表达明显最多有统计学差异(P<0.05)，组Ⅳ的VEGF表达降低有统计学差异(P<0.05)，组Ⅱ的VEGF表达与组I相比无统计学差异(P<0.05)。 [结论]：内皮祖细胞供心灌注合并环胞霉素的运用能调节免疫细胞因子和血管生长细胞因子的变化，减轻急性排斥反应。

目录

声明

引言

第一部分大鼠骨髓内皮祖细胞分离、培养和鉴定的实验研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分内皮祖细胞对大鼠混合淋巴细胞培养的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

第三部分大鼠心脏异位移植模型的建立

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第四部分内皮祖细胞灌注大鼠心脏的安全性评价

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第五部分内皮祖细胞灌注供心存活时间的研究

前言

材料与方法

结果

讨 论

结论

第六部分供体内皮祖细胞灌注供心对同种异体大鼠心脏移植急性排斥反应的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第七部分内皮祖细胞灌注大鼠同种异体心脏移植的早期细胞因子的变化

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

全文总结

参考文献

致谢

论文综述：骨髓源性间充质干细胞在心衰中的运用