细胞色素C对庆大霉素、依替米星致大鼠肾小管毒性的预防作用研究

摘要

庆大霉素、依替米星等氨基糖苷类抗生素(aminoglycosides,AGs)在临床上广泛用于治疗严重复杂性细菌感染,尤其是革兰氏阴性菌感染,但其肾脏毒性严重限制了这类药物在临床上的使用范围。大量研究表明,AGs肾毒性的发生机制与其在肾脏中蓄积进而导致肾小管上皮细胞凋亡有关。
　　细胞色素C(Cytochrome C)是从猪心中提取的细胞呼吸激活剂,是含铁卟啉的色蛋白质,临床上广泛用于各种组织缺氧的急救或辅助治疗,如一氧化碳中毒、安眠药中毒、严重休克期缺氧以及肺部疾病引起的呼吸困难和心肌缺氧等。据报道,细胞色素C80 mg/kg可以抑制低剂量庆大霉素0.1 mg/kg在大鼠肾组织中的蓄积;细胞色素C100 mg/kg可显著降低庆大霉素30 mg/kg诱导大鼠尿中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-beta-D-glucosaminidase,NAG)的量。
　　目前,有关细胞色素C减少庆大霉素在肾脏中蓄积的报道仅见于国外一篇文献,且从其研究方法看,庆大霉素的给药剂量很低,不符合其临床用量。因此,本研究将高剂量或常规剂量的庆大霉素和依替米星分别与细胞色素C联合给药,观察细胞色素C对庆大霉素或依替米星给药后在大鼠肾脏中蓄积量的影响,并观察其对庆大霉素或依替米星致大鼠肾小管上皮细胞凋亡和肾脏组织病理学改变的影响,为临床应用提供实验依据。
　　本研究分为以下2个部分:
　　1.细胞色素C对庆大霉素致大鼠肾小管毒性的预防作用研究
　　将健康雄性Wistar大鼠随机分为溶媒对照组、庆大霉素组和庆大霉素+细胞色素C组,每组10只。溶媒对照组腹腔注射生理盐水,庆大霉素组腹腔注射庆大霉素100 mg/kg/d,庆大霉素+细胞色素C组先尾静脉注射细胞色素C100 mg/kg/d,30 min后腹腔注射庆大霉素100 mg/kg/d。单剂量给药后24 h处死大鼠,以荧光偏振免疫分析(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)技术测定大鼠肾脏中庆大霉素的含量,用脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端原位标记(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)法检测肾小管上皮细胞凋亡,用CMIAS-Ⅱ(Color Medical Image Analysis System-Ⅱ,真彩色医学图像分析系统)软件计算凋亡阳性细胞数密度,用HE染色法观察肾脏组织病理学变化。结果显示,与溶媒对照组相比,庆大霉素组肾小管上皮细胞凋亡阳性细胞数密度显著增高(P<0.01);与庆大霉素组相比,庆大霉素+细胞色素C组大鼠肾脏中庆大霉素的蓄积量降低了33.86％(P<0.05),肾小管上皮细胞凋亡阳性细胞数密度下降了36.53%(P<0.05),肾小管上皮细胞水肿、空泡变性、肾间质内炎细胞浸润、肾小球充血肿胀等病理改变均有所好转。表明细胞色素 C可能通过抑制庆大霉素在肾脏中的蓄积来减轻其肾小管毒性。
　　2.细胞色素C对依替米星致大鼠肾小管毒性的预防作用研究
　　将健康雄性Wistar大鼠随机分为溶媒对照组、细胞色素 C组、依替米星10 mg/kg组、依替米星10 mg/kg+细胞色素C组、依替米星30 mg/kg组、依替米星30 mg/kg+细胞色素C组、依替米星100 mg/kg组和依替米星100 mg/kg+细胞色素C组,每组10只。溶媒对照组腹腔注射生理盐水,细胞色素C组经尾静脉注射细胞色素C100 mg/kg/d,依替米星10 mg/kg组、依替米星30 mg/kg组和依替米星100 mg/kg组分别腹腔注射依替米星10、30和100 mg/kg/d,加用细胞色素C的3组大鼠先尾静脉注射细胞色素C100 mg/kg/d,30 min后再分别腹腔注射依替米星10、30和100 mg/kg/d。各组动物均连续给药3天,最后一次给药后24 h处死大鼠,用柱前衍生化高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定大鼠肾脏中依替米星的蓄积量,用TUNEL法检测肾小管上皮细胞凋亡情况,用CMIAS-II软件计算凋亡阳性细胞数密度,用HE染色法观察肾脏组织病理学改变。结果显示,与溶媒对照组或细胞色素C组相比,依替米星10 mg/kg组、依替米星30 mg/kg组和依替米星100 mg/kg组肾小管上皮细胞凋亡阳性细胞数密度显著增高(P<0.01);与依替米星10 mg/kg组、依替米星30 mg/kg组和依替米星100 mg/kg组相比,联用细胞色素C100 mg/kg/d后,大鼠肾脏中依替米星的蓄积量分别减少了43.72%(P<0.05)、45.22%(P<0.05)和12.81%(P>0.05);肾小管上皮细胞细胞凋亡阳性细胞数密度分别减少了63.57%(P<0.01)、68.55%(P<0.01)和10.65%(P>0.05);肾组织病理改变如肾小管扩张、肾小管上皮细胞脱落、空泡变性、萎缩及肾间质内单核细胞浸润等在依替米星10 mg/kg组、依替米星30 mg/kg组明显好转。表明细胞色素C能够抑制依替米星所致的肾小管毒性,其机制可能与细胞色素C抑制依替米星在肾脏中的蓄积有关。

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前言

第一部分 细胞色素C对庆大霉素致大鼠肾小管毒性的预防作用研究

1 仪器与材料

1.1 主要仪器

1.2 药物与试剂

1.3 实验动物

2 方法

2.1 动物分组及给药

2.2 肾脏标本采集与处理

2.3 肾组织中庆大霉素药物浓度测定

2.4 肾小管上皮细胞凋亡检测

2.5 肾小管上皮细胞凋亡图像分析

2.6 肾脏组织病理学观察

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 肾组织中庆大霉素药物含量变化

3.2 肾小管上皮细胞凋亡变化

3.3 肾脏组织病理学变化

4 讨论

5 结论

第二部分 细胞色素C对依替米星致大鼠肾小管毒性的预防作用研究

1 仪器与材料

1.1 主要仪器

1.2 药物与试剂

1.3 实验动物

2 方法

2.1 色谱条件

2.2 药物及衍生化试剂的配制

2.3 动物分组及给药

2.4 肾脏标本采集与处理

2.5 依替米星药物浓度测定的方法学考察

2.6 肾组织中依替米星药物浓度测定

2.7 肾小管上皮细胞凋亡检测

2.8 肾小管上皮细胞凋亡图像分析

2.9 肾脏组织病理学观察

2.10 统计学方法

3 结果

3.1 肾组织中依替米星含量测定的方法学考察结果

3.2 肾组织中依替米星药物含量变化

3.3 肾小管上皮细胞凋亡变化

3.4 肾脏组织病理学变化

4 讨论

4.1 关于大鼠肾组织中依替米星含量测定方法的讨论

4.2 关于细胞色素C对依替米星致大鼠肾小管毒性预防作用的讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

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