EGCG通过BAFF介导的PI3K/Akt/mTOR信号通路调节胶原性关节炎大鼠B淋巴细胞功能

摘要

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)主要是以损害滑膜、软骨和骨的一种系统性免疫性疾病,尽管目前RA的病理机制还不是很明确,但生发中心的扩大、浆细胞、中性粒细胞、滑膜炎症细胞的浸润、过多的软骨形成,表明B细胞在RA的发病机制中起着重要的作用。肿瘤坏死因子家族B淋巴细胞活化因子(Bcell-activating factor belonging to the TNF family, BAFF)在B淋巴细胞发育和存活中起着关键作用,BAFF的过度表达使B细胞的自我耐受机制遭到破坏,从而导致系统性自身免疫疾病。BAFF有三个受体,B细胞活化因子受体(B cell-activating factor receptor, BAFF-R)是BAFF的其中一个受体。在体内BAFF-R对成熟的B淋巴细胞存活和外周淋巴器官内环境的稳定似乎是一个最重要的受体。BAFF/BAFF-R通过NF-κB和Bcl-2激活抗凋亡信号通路,导致抗凋亡蛋白的形成。一些研究表明 BAFF通过介导磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)催化亚基P110δ能够促进B淋巴细胞的存活和增殖,PI3K/Akt/mTOR信号通路在 BAFF应答中起着重要的作用。表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallo-catechin-3-gallate, EGCG)是一种从绿茶中提取的强抗氧化、抗炎,抗肿瘤复合物。已证实,EGCG能选择性地抑制细胞的增殖,诱导肿瘤细胞的凋亡,而对正常细胞却没有影响。近年来,EGCG抗关节炎和免疫调节的特性引起了人们的关注。本课题在建立胶原性关节炎(Collagen-induced arthritis, CIA)模型的基础上,研究BAFF是否通过介导PI3K/Akt/mTOR信号通路上调B淋巴细胞功能,并观察EGCG对该信号通路的调节作用及对B淋巴细胞功能的影响。
　　目的:
　　研究BAFF介导的PI3K/Akt/mTOR信号通路参与上调CIA大鼠B淋巴细胞功能及EGCG对该信号通路的调节作用及对B淋巴细胞功能的影响。
　　方法:
　　建立SD大鼠CIA模型,将其随机分组,免疫后18天到38天分别给予EGCG(40,80 mg/kg)和Pae(100mg/kg)处理,对CIA大鼠进行关节炎指数评分;关节和脾脏的病理检查及病理评分;ELISA法分别测定血清中BAFF、抗Ⅱ型胶原抗体、IgA、IgG和IgM的水平;免疫组化和Western blot法检测脾脏中BAFF-R, PI3K, p-Akt, mTORC1, Bcl-xL和Bim的表达;MTT法检测大鼠脾脏中B淋巴细胞的增殖反应;流式细胞术测定大鼠脾脏中B淋巴细胞的凋亡。
　　结果:
　　1、EGCG对大鼠CIA有治疗作用
　　与正常组相比,致炎后d18 CIA大鼠的前爪和后爪相继出现肿胀,d34关节炎指数和关节肿胀度达到峰值;踝关节出现滑膜细胞增殖,关节软骨破坏,炎细胞浸润;脾脏白髓增厚,生发中心扩大明显,红髓充血等。EGCG(40,80mg/kg)能明显降低CIA大鼠关节炎指数和足爪肿胀度,降低CIA大鼠关节滑膜组织增生、细胞浸润、血管翳形成、炎症和骨质侵蚀评分;EGCG(80 mg/kg)能够不同程度上减轻 CIA大鼠脾脏动脉周围淋巴鞘的细胞密度、淋巴滤泡增生、边缘区增生、红髓充血和减少生发中心的总数量。EGCG(40mg/kg)只能降低脾脏淋巴鞘的细胞密度、淋巴滤泡增生两个病理评分指标。提示EGCG对CIA大鼠有治疗作用。
　　2、EGCG降低CIA大鼠血清中IgA、IgG、IgM和抗II型胶原抗体水平
　　CIA大鼠血清中抗Ⅱ型胶原抗体、IgA、IgG、IgM水平明显升高,EGCG(80mg/kg)能够降低CIA大鼠中升高的抗Ⅱ型胶原抗体、IgA、IgG、IgM水平,EGCG(40mg/kg)只能够降低抗CIA大鼠中IgA、IgG、IgM水平。提示EGCG对CIA大鼠的治疗作用与其调节B淋巴细胞功能密切相关。
　　3、EGCG降低CIA大鼠血清中BAFF水平,下调CIA大鼠脾脏BAFF-R表达
　　CIA大鼠血清中 BAFF水平明显升高,脾脏组织 BAFF-R表达明显增多, BAFF-R主要表达在脾脏B淋巴细胞的淋巴滤泡区和边缘区,而生发中心表达相对较少。EGCG(40,80mg/kg)能够降低CIA大鼠血清中BAFF水平,降低脾脏组织BAFF-R表达。提示BAFF、BAFF-R参与了B淋巴细胞异常活化;EGCG对CIA大鼠B淋巴细胞调节作用与其下调BAFF及其受体表达相关。
　　4、EGCG下调CIA大鼠脾脏中P110δ、p-AKT1/2/3、mTORc1表达
　　CIA大鼠脾脏组织中P110δ、p-Akt1/2/3、mTORC1阳性细胞数增多,表达水平明显升高。EGCG(40,80mg/kg)能够降低CIA大鼠中升高的P110δ、p-Akt1/2/3、mTORC1表达。提示PI3K/Akt/mTOR信号通路增强与CIA大鼠B淋巴细胞增殖和存活密切相关;EGCG通过对PI3K/Akt/mTOR信号通路的调节进一步抑制B淋巴细胞的功能。
　　5、EGCG上调促凋亡蛋白,下调抗凋亡蛋白的表达,诱导B淋巴细胞凋亡
　　CIA大鼠脾脏组织中抗凋亡Bcl-xL的表达增加,而促凋亡Bim的表达减少。EGCG(40,80mg/kg)能够降低CIA大鼠中升高的Bcl-xL表达,增加CIA大鼠中降低的Bim表达。
　　由BAFF或IGF-1(pI3K激动剂)刺激后B淋巴细胞的增殖反应明显增强,而凋亡百分率明显减少。BAFF/IGF-1+EGCG(10-5,10-6,10-7 mol/L)能够明显降低B淋巴细胞的增殖反应。BAFF+EGCG(10-5,10-6mol/L)和IGF-1+EGCG(10-5 mol/L)能够诱导B淋巴细胞的凋亡。结果提示CIA大鼠B淋巴细胞凋亡蛋白间失平衡在B淋巴细胞增殖和存活中起重要作用;EGCG可能通过调节凋亡蛋白间的平衡,进一步诱导CIA大鼠B淋巴细胞凋亡。
　　结论:
　　1. EGCG对大鼠CIA有明显的治疗作用。
　　2. EGCG对CIA大鼠的治疗作用与其调节B淋巴细胞功能相关。
　　3. EGCG对CIA大鼠B淋巴细胞调节作用与其下调BAFF及BAFF-R表达相关。
　　4. EGCG通过下调PI3K/Akt/mTOR信号通路进一步抑制CIA大鼠B淋巴细胞增殖和存活功能。
　　5. EGCG通过调节凋亡蛋白的平衡诱导CIA大鼠B淋巴细胞凋亡。

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1 前言

2 实验材料

2.1动物

2.2 药物与试剂

2.3 仪器与设备

3 实验方法

3.1 大鼠CIA模型的制备

3.2 实验分组

3.3 给药方案

3.4 关节炎评分和足爪肿胀度检测[18]

3.5 关节和脾脏病理检查[19]

3.6 血清中抗II型胶原抗体的测定

3.7 血清中BAFF、IgA、IgG 和 IgM的测定

3.8 免疫组化法测定脾脏组织中BAFF-R、P110δ、P-AKT1/2/3、Bim和Bcl-xL的表达

3.9 Western blot检测脾脏组织中P110δ和mTORC1的表达

3.10 MTT法测BAFF和IGF-1诱导的B淋巴细胞增殖反应

3.11 流式细胞仪检测B淋巴细胞的凋亡

3.12 统计分析

4 结果

4.1 EGCG对大鼠CIA的治疗作用

4.2 EGCG降低CIA大鼠血清中IgA、IgG、IgM和抗II型胶原抗体水平

4.3 EGCG降低CIA大鼠血清中BAFF水平，下调CIA大鼠脾脏BAFF-R表达

4.4 EGCG下调CIA大鼠脾脏中P110δ、p-AKT1/2/3、mTORc1表达

4.5 EGCG上调促凋亡蛋白，下调抗凋亡蛋白的表达，诱导B淋巴细胞凋亡

5 讨论

5.1 EGCG对大鼠CIA有明显的治疗作用

5.2 EGCG对CIA大鼠的治疗作用与其调节B淋巴细胞功能密切相关。

5.3 EGCG对CIA大鼠B淋巴细胞调节作用与其下调BAFF及BAFF-R表达相关。

5.4 EGCG通过下调PI3K/Akt/mTOR信号通路进一步抑制CIA大鼠B淋巴细胞增殖和存活功能。

5.5 EGCG通过调节凋亡蛋白间的平衡诱导CIA大鼠B淋巴细胞凋亡。

6 结论

参考文献

附录

致谢

综述