小窝蛋白-1在大鼠肺微血管内皮细胞炎性损伤中的作用初探

摘要

目的：研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对大鼠肺微血管内皮细胞(rat pulmonary microvascular endothelial cell,RPMVEC)中小窝蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)mRNA表达的影响,观察蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)抑制剂对LPS诱导的Cav-1 mRNA表达的干预作用,为进一步研究Cav-1在急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome,ALI/ARDS)发病机制中的作用及地位奠定实验基础。
　　方法：体外分离培养RPMVEC;分别采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcript polymerase chain reaction, RT-PCR)及免疫荧光检测RPMVEC中Cav-1 mRNA及蛋白的表达;根据LPS刺激的浓度和时间差异,将RPMVEC随机分为LPS刺激量效组和时效组:量效组分别以0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml LPS与RPMVEC孵育6h,时效组以10μg/ml LPS与RPMVEC分别孵育1h、2h、3h、6h,以上均设置相应对照组;RPMVEC与PKC抑制剂双吲哚基顺丁烯二酰亚胺(bis-indolylmaleimide,BIM)预孵育1h,再与10μg/ml的LPS继续孵育6h,以上设置相应对照组;原位杂交(In situ hybridization,ISH)与JD801形态学图像分析系统检测不同条件下RPMVEC中Cav-1 mRNA的表达变化。
　　结果：1.体外成功进行RPMVEC的分离、培养,并经形态学及异硫氰酸标记的植物凝集素结合实验鉴定证实。2.RT-PCR和免疫荧光检测出RPMVEC中表达Cav-1基因和蛋白。3.LPS以浓度依赖方式诱导Cav-1 mRNA表达增加:0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml LPS分别孵育RPMVEC6h后,Cav-1 mRNA表达量随其浓度增加逐渐升高,与正常组比较差异均显著(P<0.05);10μg/ml LPS刺激RPMVEC不同时间(1h、2h、3h、6h)后,RPMVEC中Cav-1 mRNA表达水平呈动态变化:1h开始上升,2h达峰值,之后逐渐下降,但至6h仍高于正常水平(P<0.05)。4.10μmol/L BIM预孵育RPMVEC1h后,可显著下调10μg/ml LPS对Cav-1 mRNA表达的诱导效应(P<0.05)。
　　结论：1.成功进行RPMVEC的分离、培养和鉴定。2.RPMVEC表达Cav-1。3.LPS以浓度及时间依赖方式上调RPMVEC中Cav-1 mRNA的表达。4.PKC抑制剂BIM能够下调LPS对RPMVEC中Cav-1 mRNA的诱导效应。

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1 前言

2 材料与方法

2.1 RPMVEC的分离、培养和鉴定

2.2 实验分组

2.3 细胞爬片的制备

2.4. RT-PCR法检测Cav-1 mRNA

2.5 免疫荧光染色检测Cav-1蛋白

2.6 ISH检测RPMVEC中Cav-1 mRNA的表达（实验试剂配制及实验方法参照原位杂交试剂盒说明书及《精编分子生物学实验指南》进行）

2.7 统计学处理

3 实验结果

3.1 RPMVEC的分离、培养和鉴定

3.2 Cav-1 mRNA及蛋白的检测

3.3 不同剂量LPS对RPMVEC中Cav-1 mRNA表达的影响

3.4 LPS刺激不同时相对RPMVEC中Cav-1 mRNA表达的影响

3.5 BIM对LPS诱导RPMVEC中Cav-1 mRNA表达的影响

4 讨论

4.1 RPMVEC的分离、培养和鉴定

4.2 RPMVEC中Cav-1的检测

4.3 LPS对RPMVEC中Cav-1 mRNA表达的影响

4.4 PKC抑制剂BIM对LPS诱导的RPMVEC中Cav-1 mRNA表达的影响

4.5 不足及展望

5 结论

参考文献

附 录

致谢

综述