Caveolin-1对脂多糖和内脂素增加肺微血管内皮细胞通透性的作用

摘要

目的：肺微血管通透性增加及随之而来的肺间质和肺泡水肿是ARDS的重要病理特征。血管内皮通透性包括跨细胞通透性和细胞旁通透性两个方面。生理状态下，内皮细胞间连接会限制血液中生物大分子如白蛋白的通过，血管内皮对白蛋白的基础通透性主要取决于caveolae介导的跨细胞转运。也有研究表明，caveolae介导的白蛋白跨细胞转运不仅在生理状态下对维持正常组织胶体渗透压起决定性作用，而且也参与炎症刺激（如活化的中性粒细胞等）导致的肺微血管通透性增加，此过程中可观察到Cav-1磷酸化和caveolae增加。严重感染时，细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导血管内皮细胞通透性增加，目前已知的机制有LPS激活部分细胞内信号转导通路，破坏细胞间连接从而增加细胞旁通透性。关于在 LPS致肺微血管内皮细胞通透性增加过程中，跨细胞通透性如何变化及期间小窝蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）和caveolae所起作用尚未见报道。
　　Visfatin又称内脂素，是一种主要来源于内脏脂肪的新型脂肪细胞因子，具有多种生物学功能，除降低血糖、诱导脂肪细胞分化等效应外，还可促进细胞释放炎症介质，进而参与体内炎症反应，并引起血管内皮功能紊乱。另有报道visfatin可诱导细胞膜上―脂筏‖聚集，通过促进氧化应激反应等使单层内皮细胞的通透性增加，而 caveolae正是―脂筏‖中最主要的一种类型。临床资料也显示visfatin可能参与 ARDS的发生发展，但其对肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs）的直接损伤效应及作用机制是否与Cav-1有关，目前尚未见报道。
　　本课题拟检测LPS对大鼠肺微血管内皮细胞（rat pulmonary microvascular endothelial cells，RPMVECs）白蛋白内吞和跨细胞转运的影响，探讨其中Cav-1和caveolae所起的作用；再就visfatin对RPMVECs损伤与否及相关可能机制进行初步研究。
　　方法：本研究体外培养RPMVECs并鉴定，经胰酶消化传代，取2-6代细胞进行实验；先给予细胞 LPS刺激，利用A488标记白蛋白检测细胞白蛋白内吞，将RPMVECs接种于Transwell，用伊文思蓝标记白蛋白（evans blue bound to BSA，EBA）检测大分子物质跨细胞转运，电阻抗仪测定跨内皮细胞电阻值（transendothelial electrical resistance，TER）反映细胞旁通透性，同时Western blot法检测Cav-1磷酸化及转位，并用激光共聚焦显微镜观察Cav-1表达定位；然后给予PP2或甲基β环糊精（methyl-β-cyclodextrin，MβCD）预处理以抑制Src激酶活性或破坏caveolae结构，相同方法检测预处理对LPS所致上述效应的影响；另外分别用visfatin、LPS或visfatin＋LPS刺激RPMVECs，Western blot法了解PKC活化及Cav-1、ERM磷酸化程度，检测EBA透过细胞单层及TER的变化，并用FITC-鬼笔环肽经荧光显微镜观察细胞肌动蛋白骨架；再用TER反映PKC抑制剂—BIM对visfatin致细胞通透性变化的影响。
　　结果：
　　1.体外成功分离培养 RPMVECs，并经形态学、CD34和FITC-异植物凝集素（FITC-BSI）结合实验证实。
　　2.10μg/ml LPS刺激RPMVECs，Cav-1第14位酪氨酸残基的磷酸化自刺激后5min开始升高，30min达高峰，60min时有所下降，但仍高于基础值，于相同时相点检测总Cav-1，未见其蛋白含量变化。
　　3.10μg/ml LPS刺激RPMVECs，western blot法测得Cav-1自Triton可溶区域向Triton不可溶区域的转位（translocation）自刺激后5min开始增加，15min时达高峰，之后逐渐下降但仍持续至60min以后，同时激光共聚焦显微镜下可见LPS刺激15min时Cav-1明显自胞膜向胞浆内转移。
　　4.10μg/ml LPS刺激RPMVECs15min，镜下见RPMVECs对A488标记白蛋白的内吞增加，相同时相点EBA经Transwell中细胞单层的通透性开始增加，但此时TER尚未见明显变化，继续观察发现TER自LPS刺激30min才开始降低。
　　5.15μmol/L PP2预处理RPMVECs可明显减少LPS诱导的Cav-1磷酸化（P＜0.05），15μmol/L PP2或2.0mmol/L MβCD预处理均可使LPS诱导的Cav-1转位减少（P＜0.05）。
　　6.15μmol/L PP2或2.0mmol/L MβCD预处理RPMVECs明显抑制LPS诱导的A488标记白蛋白内吞增加，减少LPS刺激15min时EBA的通透性。
　　7.0.5μg/ml visfatin单独刺激RPMVECs15min并不能使EBA经细胞单层的通透性增加，但加重此时LPS致白蛋白跨细胞通透性增加的程度。
　　8.0.5μg/ml visfatin单独刺激RPMVECs，自刺激30min后TER开始下降，至少持续至180min，同时可观察到细胞F-actin骨架排列紊乱，与10μg/ml LPS引起RPMVECs的TER及F-actin骨架变化类似但程度较轻，而visfatin+LPS共同作用的损伤效应更加显著。
　　9.0.5μg/ml visfatin刺激RPMVECs30min时，western blot法显示细胞PKC被激活转位，同时Cav-1和ERM磷酸化水平增加。
　　10.1μmol/L BIM预处理RPMVECs可明显减轻visfatin引起的单层细胞TER降低的程度。
　　结论：
　　1. LPS呈时间依赖性增加RPMVECs上Cav-1的磷酸化，并促使Cav-1表达转位。
　　2. LPS诱导的Cav-1磷酸化部分受Src激酶调控，抑制Src激酶或破坏cavelae结构均可抑制Cav-1转位。
　　3. LPS刺激 RPMVECs，细胞内吞白蛋白和跨细胞转运的增加先于细胞旁通透性的增加，Cav-1的磷酸化和表达转位是其关键环节。
　　4. visfatin单独刺激RPMVECs并不能引起与LPS类似的白蛋白跨细胞通透性增加，但可使细胞骨架排列紊乱，细胞间隙加大，细胞旁通透性增加，并能够与LPS协同作用，加重损伤。
　　5. visfatin增加RPMVECs单层细胞通透性依赖于PKC途径的激活，并与Cav-1和ERM磷酸化有关。

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1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3.实验方案

2.4.统计学处理

3 结果

3.1 成功分离、培养RPMVECs并鉴定

3.2 LPS依赖Src激酶及caveolae诱导RPMVECs上Cav-1蛋白表达转位及磷酸化水平增加

3.3 LPS增加RPMVECs的白蛋白跨细胞通透性，并有赖于Cav-1的磷酸化以及caveolae结构

3.4 visftin增加RPMVECs的单层通透性，并可与LPS协同加重细胞损伤

4 讨论

1 RPMVECs的分离、培养和鉴定

2. LPS经Cav-1及caveolae诱导RPMVECs跨细胞通透性增加

3.visfatin可通过Cav-1、PKC等途径引起PRMVECs细胞通透性增加，并加重LPS的损伤作用

全文结论

不足之处和工作计划

参考文献

个人简历

致谢

综述: 脂肪细胞因子调节炎症反应的研究进展