递送siRNA的EGFR靶向免疫脂质体的制备及其体内外活性研究

摘要

基因治疗是目前治疗遗传性疾病或后天获得性疾病比较理想的治疗手段，尤其是恶性肿瘤的治疗。RNAi （RNA interfering, RNA 干扰）作为一种高效的序列特异性基因沉默技术在恶性肿瘤基因治疗领域发展掀起了一股研究热潮，其中，siRNA （smallinterfering RNA,小干扰RNA）是RNAi 路径中的效应分子，它是一种21～23 bp的短片段双链RNA，能够特异性降解同源序列的mRNA，抑制特异肿瘤相关基因的表达，从而达到抑制肿瘤生长、侵袭和转移的目的。然而，如果没有载体的帮助，siRNA 无法进入肿瘤细胞内，载体是制约siRNA基因治疗的首要问题，所以，siRNA的递送载体研究是目前肿瘤基因治疗研究的热点问题。阳离子脂质体是目前应用较为广泛的递送siRNA的一种非病毒载体，它具有无毒、可自然降解、无免疫原性、可以大量合成并放大生产等优点，近年来备受研究者的重视。　　 本课题组前期一直致力于递送siRNA的阳离子脂质体的制备和活性研究，前期研究发现，通过对阳离子脂质体进行PEG （聚乙二醇）化、HER2抗体修饰以及冷冻干燥等处理后制备得到一种PEG 化免疫冻干脂质体（Lyophilized PEGylatedImmunoliposomes, LPIL）,这种脂质体在PEG 含量为2.5 mol％时，能有效的将siRNA特异性递送至高表达HER2 乳腺癌细胞内并沉默相关基因的表达。PEG能显著提高脂质体在血浆中的稳定性，延长药物体内半衰期，当PEG 含量大于8 mol％时，粒径为100nm 左右的脂质体表面呈刷状，这种刷状构象能完全覆盖脂质体表面，为脂质体免于网状内皮系统的吞噬提供更全面的保护。然而LPIL的PEG 含量较低，体内应用受到限制。并且，LPIL 无法引入较高含量的PEG，因为较高含量的PEG 会破坏LPIL的物理稳定性，而且会大大降低siRNA的包封率。所以我们亟待发展一种高PEG含量、高siRNA 包封率以及靶向性较好的阳离子脂质体。　　 LPD （liposome-polycation-DNA，脂质体-多聚阳离子-DNA 复合物）是一种新型递送siRNA的阳离子脂质体，它的结构是PEG （聚乙二醇）化的包裹鱼精蛋白、siRNA/DNA 复合物的阳离子脂质体，与传统阳离子脂质体不同的是，DNA在鱼精蛋白的作用下将siRNA 压缩，三者形成一个紧密的带负电的核，与阳离子脂质体混合后通过自组装过程形成稳定的LPD，尤为重要的是，LPD 采用后插入PEG的方法在其表面修饰了高含量的PEG，不但保证了siRNA的高包封率，而且有效地增加了脂质体的稳定性，在体内被证明能有效地递送siRNA 至肿瘤细胞中。然而，抗体修饰的LPD 尚无人系统探讨过其各种纳米表征和体内外活性。本研究正是在前期PEG 化免疫阳离子脂质体和LPD的基础之上，通过一系列的处方筛选，首次优化出一种高PEG 含量的EGFR靶向免疫脂质体TLPD-FCC，并对其各种纳米表征及其体内外活性进行了较为深入的研究和探讨。首先，我们将DOTAP/Chol 阳离子脂质体与鱼精蛋白、小牛胸腺DNA、siRNA混合得到Naked LPD （非PEG 化脂质体），然后通过PEG 化和引入抗体（Anti-EGFRmAb 或Fab’），制备得到EGFR靶向免疫脂质体TLPD，针对抗体对脂质体粒径大小以及zeta 电位的影响，对抗体类型、连接方式和投入量进行优化，结果发现抗体类型为Anti-EGFR Fab’，且采用传统连接方式连接的抗体时制备得到的脂质体TLPD-FC，平均粒径在150nm～160nm 之间，zeta 电位在10mV 左右，为后续实验研究奠定了基础。　　 然后，通过SDS-PAGE 实验证实抗体确实已经连接到脂质体，同时考察了Naked-LPD、NTLPD （PEG 化非靶向脂质体）、TLPD-FC对siRNA 结合能力、siRNA的包封率以及体外基因沉默效率。凝胶阻滞实验结果表明Naked-LPD、NTLPD、TLPD-FC对siRNA 均具有较强的结合能力，通过超滤离心的方法证实了siRNA 包封率高达90％，以上实验证实上述样品对siRNA 很强的包裹能力，并且PEG 化或者抗体修饰对siRNA 包封率影响较小。体外基因沉默效率考查了抗体投入量不同时TLPD-FC （包括TLPD-FCA、TLPD-FCB、TLPD-FCC、TLPD-FCD）在MDA-MB-231细胞中的基因沉默效率，结果表明TLPD-FCC 具有最高的基因沉默效率。　　 最后，对TLPD-FCC的相关性质和体内外活性进行了深入的研究和探讨。通过透射电镜观察TLPD-FCC和NTLPD的形态大小发现，两者在形态和大小分布上没有明显区别，表明了抗体连接对脂质体的结构几乎没有影响。琼脂糖凝胶电泳实验证实了siRNA在TLPD-FCC 或NTLPD的保护下血清稳定性良好。脂质体的血清稳定性通过动态光散射实验得到结论：与Naked LPD 相比，NTLPD 或TLPD-FCC在PEG的保护下不易与BSA 相互作用，稳定性好。体外基因转染效率和基因沉默效率结果表明与NTLPD 相比，TLPD-FCC 具有较高的特异性的转染效率和基因沉默活性。随后，通过MDA-MB-231乳腺癌肿瘤模型的建立，免疫荧光标记实验证实了体内肿瘤细胞的EGFR表达水平，体内分布实验也验证了TLPD-FCC通过受体介导内吞机制，随着时间的变化在肿瘤部位高度聚集，达到峰值，且激光共聚焦结果显示，TLPD-FCC显示出比NTLPD 更高的肿瘤细胞靶向特异性和结合能力及内吞效率。最终，体内基因沉默效率的考察结果表明TLPD-FCC 具有比NTLPD 更高的基因沉默效率，具有特异性的基因沉默活性。　　 本研究制备得到的TLPD-FCC能有效地递送siRNA 至高表达EGFR的乳腺癌细胞，并具有良好的体内外基因沉默效率，有可能作为一种治疗高表达EGFR 乳腺癌的基因载体用于临床。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前 言

第一章 TLPD 的制备及抗体类型、连接方式和投入量的优化

第二章 TLPD-FC 的体外研究

第三章 TLPD-FCC 的性质和体内外活性研究

全文小结

参考文献

综述 阳离子脂质在基因传递中构效关系的研究进展

在读期间参加科研工作情况

致 谢