用于核移植表达rHSA嵌合HLA-YAC的山羊胎儿成纤维细胞株的制备

摘要

转基因动物主要用于基因功能研究、人类遗传病动物模型以及在乳汁中表达重组蛋白,然而常规载体转基因由于受整合位点以及构件本身缺陷的影响,表达的不确定性是其主要缺陷,解决的主要途径之一就是利用具有独立表达域的基因组大片断作为表达框架来排除位置效应.酵母人工染色体(YAC)巨大的克隆能力能满足这个要求,YAC克隆(YACs)转基因在大部分情况下表现出了位置独立性、拷贝数依赖性、组织特异性以及与内源性基因相当的表达水平.本实验利用从法国人类多态性研究中心(CEPH)YAC库筛选出的含人α-乳白蛋白基因(human α-lactalbumin gene,hα-Lac)的长约210kb的YAC(HLA-YAC),用于在转基因羊的乳汁中表达人血清白蛋白(human serum albumin,HSA).CEPH YAC库是用酵母AB1380菌株构建的,该菌株缺少可用的遗传筛选标记,这给YACs的遗传学操作带来了难度.为了便于同源重组的筛选,借助YPH925的kar1突变,使YPH925菌株与异交配型菌株交配时丧失核融合的能力,通过单个染色体在酵母间的转移,在药物筛选的条件下,把HLA-YAC由酵母AB1380转移到his3缺陷的YPH925菌株,经脉冲凝胶电泳和PCR方法证实,YPH925获得了来自AB1380的HLA-YAC.为了探索用不同的筛选标记在酵母中对HLA-YAC定点打靶的可行性,构建了包含HIS3(对YPH925菌株)和G418R(对YPH925和AB1380两种菌株)两个筛选标记,以及hα-Lac的5'和3'端非翻译区各684 bp和940 bp的两个同源臂的打靶载体,用电转化或醋酸锂转化转入酵母内,初步以组氨酸缺陷或G418筛选,再以菌落PCR鉴定,并经克隆测序验证.结果显示,HLA-YAC受到了相应的定点打靶修饰,G418R的筛选效率高于HIS3,醋酸锂转化方法的阳性获得率稍高于电转化.

目录

文摘

英文文摘

缩略词

第一部分文献综述—酵母人工染色体及其转基因动物

1.1前言

1.2酵母人工染色体(YAC)

1.2.1 YAC的背景知识

1.2.2 YAC载体和菌株的发展

1.3 YAC克隆的不稳定性和嵌合性

1.3.1 YAC克隆的不稳定性

1.3.2嵌合YAC克隆

1.4 YAC插入子的遗传学操作

1.4.1 YAC插入子的遗传操作应用

1.4.2选择性标记

1.5用于转基因研究的YAC载体的优化

1.6 YAC转基因动物的制备

1.6.1酵母和ES细胞融合

1.6.2 ES细胞的脂质体转染

1.6.3原核显微注射

1.7 YAC DNA的纯化

1.8 YAC转基因小鼠的鉴定与结构性分析

1.8.1详细结构分析的方法

1.8.2整合位点和拷贝数分析

1.9 YAC转基因鼠的表达研究

1.9.1通过对插入YAC内的序列进行突变来研究基因表达的顺式调控元件

1.9.2生物反应器

1.9.3人类疾病的动物模型

1.10大动物的YAC转基因

1.11结束语

参考文献

第二部分不同条件下HLA-YAC高效定点打靶修饰方法的建立

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1 HLA-YAC由AB1380转移至YPH925

2.2打靶载体的酶切鉴定

2.3以选择标记的筛选作用对定点整合的初步筛选

2.4菌落PCR鉴定

2.5克隆pG7-8测序结果

3讨论

参考文献

第三部分乳腺特异性表达rHSA嵌合体YAC载体的构建

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1打靶载体的酶切鉴定

2.2酵母内的HLA-YAC同源重组菌落PCR鉴定结果

2.3酵母内的HLA-YAC同源重组Southern鉴定结果

3讨论

参考文献

第四部分用于核移植克隆表达rHSA嵌合HLA-YAC山羊胎儿成纤维细胞株的制备

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1酵母原生质体与羊的胎儿成纤维细胞融合

2.2抗性克隆的PCR鉴定

2.3抗性克隆的Southern鉴定

3 讨论

参考文献

结论

发表文章目录

致谢