GRIM-19对子宫颈癌细胞端粒酶活性及细胞衰老的影响

摘要

研究背景
　　子宫颈癌是女性三大恶性肿瘤中最常见的,居后的是乳腺癌和直肠癌,它也是女性癌症相关死亡的的主要原因。该病严重威胁着女性的健康和生命,全世界每年大约有53万新发的子宫颈癌病例,约有27万女性死于子宫颈癌,其中80％左右发生在发展中国家。发病率最高的是南非,其次是亚洲。我国每年新发病例约13万例,占全世界新发病例的近1/4。子宫颈癌的病因迄今尚未完全明确。研究表明90%以上的子宫颈癌伴有高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染,其中主要是16、18两种亚型。高危型HPV持续感染在子宫颈癌的发生和发展中起着重要的作用,70%以上的子宫颈癌组织中存在着HR-HPV基因组的整合。
　　端粒是染色体末端形成的特殊帽子结构,使染色体不会随着复制后的RNA引物的降解而缩短,也使染色体末端减少融合,从而维持着染色体结构的稳定性和完整性。随着细胞的有丝分裂端粒也逐渐缩短,从而引起细胞的衰老和死亡,而端粒长度的维持靠端粒酶来不断合成新的端粒序列。
　　端粒酶是一种反转录DNA聚合酶,它以自身mRNA为模板在hTert的逆转录作用下进行DNA的合成,加到染色体末端,维持端粒的长度。端粒酶结构组成主要包括三部分:hTerc,hTert,Dyskerin。大多数体细胞中检测不到端粒酶活性,而在高度增殖的细胞如干细胞、生殖细胞、85%-95%的肿瘤细胞中可以检测到端粒酶的表达。端粒缩短和端粒酶的再激活在肿瘤发生发展过程中起着很重要的作用,一方面端粒缩短可以引起染色体不稳定和肿瘤的启动,另一方面肿瘤的形成需要端粒酶的再激活来稳定端粒的消耗。端粒酶的活化与肿瘤的进展、不良预后、复发的危险性密切相关。端粒长度的维持和端粒酶的活性与肿瘤细胞的永生化也密切相关。
　　GRIMs(genesassociatedwithretinoid-IFN-inducedmortality)是近几年发现的一群参与干扰素(interferon,IFN)和维甲酸(retinoicacid,RA)合并诱导的细胞凋亡基因,由Kalvakolanu,etal应用反义基因敲除的方法分离发现并首先报道的细胞凋亡蛋白。GRIM-19(geneassociatedwithretinoid-interferonmortality-19),是GRIMs家族的重要成员,是由IFN联合RA诱导表达的一种细胞凋亡调节因子,定位于19p13.2,该区的多种基因为前列腺癌的抑制基因。GRIM-19编码含144个氨基酸残基的蛋白质,分子量约16kd,其主要定位在线粒体,细胞核也有少量表达,在人体多种正常组织中均有其表达。GRIM-19参与细胞线粒体的呼吸作用,并参与细胞增殖和凋亡的调控过程,其表达降低或位点的突变可以导致细胞的异常增殖和恶性转化。在某些肿瘤如肾癌、口腔癌、结直肠癌、甲状腺肿瘤等均发现GRIM-19表达的降低。但GRIM-19在子宫颈癌的发生、发展中所发挥的具体作用目前尚不明确。
　　本课题组前期试验已经证实在子宫颈癌细胞株SiHa,HeLa和CaSki细胞中均发现GRIM-19可以上调p53及其下游基因p21的表达,而在HPV阴性的卵巢癌细胞株H08910细胞中却并未发现该现象。本实验将以端粒酶为研究对象,进一步探讨GRIM-19对子宫颈癌细胞中端粒酶活性及细胞衰老的影响。
　　目的
　　研究子宫颈癌细胞中GRIM-19对子宫颈癌细胞中端粒酶活性及细胞衰老的影响,为宫颈癌的生物治疗提供新的理论依据和治疗思路。
　　方法
　　(1)构建GRIM-19真核表达质粒:p3×Flag-GRIM-19(p3×Flag-CMV-Myc-24-GRIM-19);(本课题组实验室前期已构建完成);(2)采用蛋白印迹法(WB)检测GRIM-19对hTert,Dyskerin,P16及P21蛋白表达的影响;(3)细胞衰老试剂盒检测GRIM-19对细胞衰老的影响;(4)采用免疫组化法方法检测GRIM-19与Ki67蛋白表达影响;(5)采用Fish方法检测GRIM-19对hTerc基因扩增的影响;(6)采用Elisa-Trap法检测端粒酶活性;
　　结果：
　　(1)WB)检测结果显示在宫颈癌细胞株HeLa与SiHa细胞中GRIM-19能降低hTert蛋白表达,上调dyskerin,P16及P21蛋白表达;(2)细胞衰老试剂盒检测结果示GRIM-19增加细胞衰老;(3)免疫组化法方法检测GRIM-19减少Ki67蛋白表达;(4)Fish方法检测GRIM-19对hTerc基因扩增无明显作用;(5)Elisa-Trap法检测结果显示GRIM-19可以降低端粒酶活性。
　　结论
　　GRIM-19可以降低子宫颈癌细胞端粒酶活性,并增加细胞衰老程度。

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1 前言

2 材料和方法

2.1材料

2.2 方 法

2.3 统计数据处理

3 结果

3.1 GRIM-19对HeLa细胞端粒酶活性的影响

3.2 GRIM-19对HeLa细胞衰老的影响

3.3 重组质粒GRIM-19转染HeLa细胞，检测hTerc基因扩增、DKC-1蛋白表达的变化

3.4 重组质粒转染HeLa细胞后，GRIM-19及hTert、P16、P21蛋白的表达水平

3.5 GRIM-19对SiHa细胞端粒酶活性的影响

3.6 GRIM-19对SiHa细胞衰老的影响

3.7 重组质粒转染SiHa细胞后，GRIM-19及hTert,DKC-1,P16,P21蛋白的表达水平

4 讨论

4.1 GRIM-19可以降低子宫颈癌细胞株HeLa、SiHa 细胞端粒酶活性

4.2 GRIM-19可以增加子宫颈癌细胞株细胞株HeLa、SiHa 细胞衰老

4.3 结语与展望

5 结论

参考文献

附录

致谢

综述