Notch1/Jagged1信号对人肝癌SMMC 7721细胞增殖和侵袭的影响及其作用机制

摘要

目的:以细胞培养技术为基础,检测在Notch信号通路的激活和失活状态下人肝癌细胞株SMMC7721增殖和侵袭等一系列生物学行为的变化。在不同的Notch信号通路活化状态下检测Bcl-2、Snail等基因mRNA的表达情况,初步探讨其生物学行为变化的可能机制,进一步拓宽肝癌的发病机理。
　　方法:体外培养人肝癌SMMC7721细胞,至对数生长期,利用RT-PCR技术检测细胞中Notch信号通路各组分的表达情况,了解Notch信号通路在该细胞系中的活化状态。进而将细胞进行分组:①激活剂组(向细胞中加入Notch信号通路特异性激活剂Jagged1蛋白),②抑制剂组(向细胞中加入Notch信号通路特异性抑制剂DAPT)③空白对照组(只加入PBS液)。MTT法和软琼脂集落形成试验检测各组细胞增殖的情况,Transwell小室法观察细胞侵袭的能力,RT-PCR检测各组细胞中Hes-1、Bcl-2及Snail基因mRNA的表达。
　　结果:①SMMC7721细胞中存在Notch1/Jagged1信号系统的表达,培养12、24、36、48h后,激活剂组细胞A值分别为0.809±0.032、0.543±0.016、0.466±0.031、0.376±0.009,空白对照组分别为0.952±0.024、1.119±0.064、1.457±0.028、1.539±0.022,抑制剂组分别为1.063±0.071、1.452±0.022、1.687±0.017、1.814±0.032。激活剂组、抑制剂组与对照组比较,P均<0.05。②激活剂组、空白对照组、抑制剂组的体外细胞克隆形成数分别为17.4±6.3、26.0±3.4和43.2±7.3,激活剂组、抑制剂组与对照组比较,P均<0.05。③激活剂组、空白对照组和抑制剂组的细胞侵袭数分别为43.8±6.8、64.6±5.6和90.0±6.9(P<0.05)。④激活剂组细胞中Hes-1基因的表达增强,Bcl-2及Snail基因的表达显著降低;相反,抑制剂组细胞的Hes-1基因表达降低,Bcl-2及Snail基因的表达显著增强(P<0.05)。
　　结论:利用Jagged1蛋白和DAPT是一种切实可行的双向调控Notch信号通路的方法。Notch1/Jagged1信号通路在人肝癌SMMC7721细胞的增殖和侵袭中发挥重要的调控作用,其机制初步认为可能与下调抗凋亡基因Bcl-2以及肿瘤转移相关基因Snail的表达有关,具体机制尚待进一步深入研究。

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1 引言

2 实验材料

2.1. 主要试剂

2.2 主要仪器

2.3 主要试剂的配制

3 方法

3.1 细胞培养

3.2 半定量RT-PCR分析SMMC 7721细胞中Notch信号通路各受体和配体的表达情况

3.3 细胞分组

3.4 MTT法检测细胞增殖

3.5 软琼脂集落形成试验

3.6 Transwell 小室检测细胞侵袭力

3.7 RT-PCR 检测 SMMC 7721 细胞中 Hes-1、Bcl-2 及 Snail 基因的表达3.7.1 Trizol 提取细胞总RNA

4 统计学处理

5 结果

5.1 Notch 信号系统的表达

5.2 SMMC 7721 细胞增殖能力的变化

5.3 软琼脂集落形成能力

5.4 SMMC 7721 细胞侵袭能力的变化

5.5 SMMC 7721细胞中Hes-1、Bcl-2及Snail基因的表达情况

6 讨论

6.1 Jagged 1 蛋白、DAPT与Notch信号通路的关系

6.2 Notch信号对SMMC 7721细胞生物学行为的影响

6.3 Notch信号通路与肿瘤预后及肿瘤耐药性

6.4 Bcl-2、Snail基因与SMMC 7721细胞生物学行为的关系

6.5 Notch信号通路与肝癌

7 结论

参考文献

附 录

致谢

综述