异丙酚预先给药对HepG2细胞缺氧复氧损伤内质网应激的影响

摘要

内质网(endoplasmic reticulum)是真核细胞中由膜围成的隧道系统,是一种重要的细胞器,其基本生理功能包括蛋白质的合成、修饰、加工、转运以及Ca2+浓度的调节等。内质网对细胞内稳态失衡高度敏感,肝细胞缺氧复氧时细胞内ATP耗竭、大量氧自由基的产生和钙离子平衡紊乱,可导致大量未折叠或错误折叠蛋白堆积于内置网,引起内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress,ERS)。
　　ERS是细胞一种自我保护机制,细胞为适应外界的不良刺激,维持内质网环境的稳态,相继活化一系列信号转导通路,通过增强内质网的蛋白折叠能力,加速内质网相关蛋白降解,减少新生蛋白向内质网转运。持续或者过强的ERS使得内质网的稳态不能重建,引起细胞自噬和凋亡造成细胞损伤。ERS途径诱导细胞凋亡是不同于死亡受体途径和线粒体途径的第3种细胞凋亡途径。ERS可通过C/EBP同源蛋白(CHOP)、C-JUN氨基末端激酶(JNKs)和Caspase-12途径导致细胞的凋亡。
　　异丙酚(Propofol)是一种非巴比妥类静脉麻醉药,因其起效快,苏醒迅速而完全,持续输注后不易蓄积,目前普遍用于麻醉诱导、镇静及麻醉维持。研究表明,肝脏缺血前给予异丙酚,可提高其对肝损伤的耐受能力,减轻肝脏缺血再灌注损伤。但其具体机制尚不清楚,可能与其抗氧化、清除氧自由基和上调血红素氧合酶-1(Hemeoxygenase-1,HO-1)的活力等有关。
　　目的:
　　本实验评价异丙酚预先给药对HEPG2细胞缺氧复氧损伤内质网应激的影响,探讨其减轻HEPG2细胞缺氧复氧损伤的机制,为指导临床麻醉用药提供理论依据。
　　方法:
　　1、采用物理缺氧复氧的方法制备HEPG2细胞缺氧复氧损伤模型,模拟临床的肝脏缺血再灌注损伤模型。采用随机数字表法将HEPG2细胞随机分为5组:正常对照组(control组)、缺氧6h复氧12h(H6/R12)组、缺氧12h复氧12h(H12/R12)组、缺氧24h复氧12h(H24/R12)组和缺氧48h复氧12h(H48/R12)组。采用MTT比色法检测HEPG2细胞的相对增值情况,OD值下降40％作为缺氧复氧模型制备成功的标准。
　　2、明确异丙酚减轻细胞缺氧复氧损伤的最适药物浓度,采用随机数字表法,将HEPG2细胞随机分为6组:正常对照组(control组)、缺氧复氧组(H/R组)和缺氧复氧+异丙酚(5μmol)组(H/R+PPF5组)、缺氧复氧+异丙酚(10μmol)组(H/R+PPF10组)、缺氧复氧+异丙酚(20μmol)组(H/R+PPF20组)和缺氧复氧+异丙酚(40μmol)组(H/R+PPF40组)。采用MTT比色法检测HEPG2细胞的相对增值率,10μmol异丙酚用于后续实验研究。
　　3、采用随机数字表法将HEPG2细胞随机分为4组:正常对照组(control组)、异丙酚10μmol组(PPF组)、缺氧24 h复氧12h(H/R)组和缺氧24 h复氧12h+异丙酚10μmol组(H/R+PPF组)。采用Western bloting(WB)方法检测内质网应激相关蛋白:免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、真核细胞转录起始因子(eIF2α)、活化转录因子4(ATF4)和凋亡相关蛋白活化型Caspase-3的表达;采用RT-PCR的方法检测BIP mRNA、CHOP mRNA、和Caspase-3mRNA的表达。
　　4、统计学处理:采用SPSS13.0统计学软件进行实验数据分析,计量资料用均数±标准差(xs)表示,单因素方差分析用于不同组间比较,P<0.05为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1.缺氧复氧对HEPG2细胞活力的影响
　　与control组比较,H24/R12组细胞增值率下降(P<0.05),由0.686±0.045下降至0.404±0.033,下降约40%。
　　2.不同浓度异丙酚对缺氧复氧(H/R)损伤HepG2细胞相对增值率的影响
　　MTT比色法结果显示:与control组比较,H/R组和H/R+PPF组细胞OD值下降,细胞相对增值率下降(P<0.05);与H/R组比较,H/R+PPF10组细胞OD值由0.303±0.030增加至0.505±0.079,细胞相对增值率增加最为显著。
　　3.异丙酚(10μmol/L)对H/R损伤HepG2细胞凋亡相关蛋白活化型Caspase-3表达的影响
　　与control组相比,H/R组和H/R+PPF10组细胞凋亡相关蛋白剪切型Caspase-3表达显著上调(*P<0.05);与 H/R组比较,H/R+PPF10组细胞凋亡相关蛋白剪切型Caspase-3的表达显著下调(＃P<0.05)。
　　4.异丙酚(10μmol/L)对H/R损伤HepG2细胞Caspase-3 mRNA表达的影响
　　与control组相比,H/R组和H/R+PPF10组细胞Caspase-3 mRNA表达显著上调(*P<0.05);与H/R组比较,H/R+PPF10组细胞Caspase-3 mRNA的表达显著下调(＃P<0.05)。
　　5.异丙酚(10μmol/L)对H/R损伤HepG2细胞内质网应激相关蛋白BIP和CHOP表达的影响
　　与control组相比,H/R组和H/R+PPF10组细胞内质网应激相关蛋白BIP和CHOP的表达显著上调(*P<0.05);与H/R组比较,H/R+PPF10组细胞的BIP和CHOP表达显著下调(＃P<0.05)。
　　6.异丙酚(10μmol/L)对H/R损伤HepG2细胞BIP mRNA和CHOP mRNA表达的影响
　　与control组相比,H/R组和H/R+PPF10组细胞BIP mRNA和CHOP mRNA的表达显著上调(*P<0.05);与H/R组比较,H/R+PPF10组细胞BIP mRNA和CHOP mRNA的表达显著下调(＃P<0.05)。
　　7.异丙酚(10μmol/L)对H/R损伤HepG2细胞p-PERK、p-eIF2α和ATF4表达的影响
　　与control组相比,H/R组和H/R+PPF10组细胞p-PERK、p-eIF2α和ATF4的表达显著上调(*P<0.05);与H/R组比较,H/R+PPF10组细胞p-PERK、p-eIF2α和ATF4的表达显著下调(＃P<0.05)。
　　结论:
　　1.异丙酚预先给药可通过抑制细胞凋亡减轻HEPG2细胞缺氧复氧损伤;
　　2.异丙酚预先给药可通过抑制内质网应激减轻细胞凋亡;
　　3.异丙酚抑制内质网应激反应的作用主要是通过抑制未折叠蛋白反应中的PERK-eIF2α-ATF4这条途径实现。

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1 前言

2 实验材料

2.1 细胞株

2.2抗体

2.3 主要实验材料来源和试剂的配制

2.4 引物设计与合成

2.5 实验仪器

3 实验方法

3.1 实验设计和分组

3.2 细胞培养和缺氧复氧模型的制备

3.3 MTT法检测细胞相对增值率

3.4 蛋白质印迹（Western blotting，WB）

3.5 RT-PCR

3.6 统计学处理

4 结果

4.1 缺氧复氧对HEPG2细胞活力的影响

4.2 不同浓度异丙酚对缺氧24 h 复氧12 h （H/R）损伤HepG2细胞相对增值率的影响

4.3异丙酚(10μmol/L)对H/R损伤HepG2细胞凋亡相关蛋白剪切型Caspase-3表达的影响

4.4 异丙酚(10μmol/L)对H24/R12损伤HepG2细胞凋亡相关蛋白剪切型Caspase-3mRNA表达的影响

4.5 异丙酚(10μmol/L)对H/R损伤HepG2细胞内质网应激相关分子BIP和CHOP蛋白表达的影响

4.6异丙酚(10μmol/L)对H/R损伤HepG2细胞BiP mRNA、CHOP mRNA表达的影响

4.7 异丙酚(10μmol/L)对H/R损伤HepG2细胞 p-PERK、 p-eIF2α和 ATF4表达的影响

5 讨论

6 结论

7本研究的创新点

8展望

参考文献

附录

致谢

综述