异丙酚后处理对缺氧复氧损伤内皮细胞MiRNAs表达谱的影响及与自噬信号通路的关系

摘要

目的：通过观察异丙酚后处理缺氧复氧损伤人脐静脉内皮细胞前后MiRNAs表达谱的变化，分析差异表达MiRNAs靶基因的蛋白质调控网络，旨在揭示异丙酚后处理对缺氧复氧损伤内皮细胞产生的保护作用及分子机理。 方法：将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)置于密闭良好的缺氧复氧特殊装置中，冲入高纯氮气置换装置里的空气造成缺氧，无糖无血清培养12小时，复氧时迅速打开装置并更换高糖含20％胎牛血清的培养液放在正常的培养箱中培养4小时，同时加入不同浓度的异丙酚(25μmol/L-150μmol/L)。依据上述方法建立异丙酚后处理缺氧复氧损伤模型后，实验分为异丙酚后处理内皮细胞缺氧复氧损伤组（H/R+P-PostC）;缺氧复氧损伤组(H/R);正常对照组(NC)。用CCK-8试剂盒检测各组细胞活力，用Annexin-Ⅴ-FITC/PI流式双染法检测细胞早晚期凋亡率。Western Blot检测凋亡相关蛋白和LC3的表达，同时用免疫荧光检测自噬相关蛋白LC3的表达。MiRNA芯片检测H/R+P-PostC组和H/R组的相关MiRNA变化，并对变化的MiRNA进行荧光实时定量验证PCR(Q-PCR)。分析预测相关MiRNA的靶基因，用Gene Ontology(GO)的方法构建信号网络通路。 结果：⑴异丙酚后处理增加缺氧复氧损伤内皮细胞的活力:与NC组相比H/R组的细胞活力值为(55.9±1.8)％（P＜0.01）。H/R+P-PostC组与H/R组相比，细胞活力增加(P＜0.05)。并且除了150μmol/L组以外H/R+P-PostC组的细胞活力随着异丙酚浓度增加而增加分别为(68.1±5.3)％，(69.4±3.6)％，(72.2±5.7)％，(62.5±6.7)％。异丙酚后处理减轻缺氧复氧损伤内皮细胞的凋亡率:与H/R组相比，H/R+P-PostC组的早期凋亡率减少(P＜0.05)。异丙酚后处理缺氧复氧损伤内皮细胞细胞增加了抑制凋亡相关蛋白Bcl-2的表达降低了凋亡相关Bax蛋白的表达，并且抑制了缺氧复氧损伤引起的PARP蛋白的切割(P＜0.05）。提示异丙酚可以减轻内皮细胞缺氧复氧损伤。⑵P-Post+H/R组与H/R组比较，MiRNA芯片检测出14个差异表达的MiRNAs。对其中的hsa-miR-30b，hsa-miR-20b，hsa-miR-15b等6个MiRNAs进行了实时荧光定量PCR验证，其中3个表达增加，3个表达下降（P＜0.05）。⑶而其中10个差异表达的MiRNAs的目的基因均为自噬相关基因，构建了相关自噬信号通路调控网络，同时异丙酚后处理缺氧复氧损伤内皮细胞可以增加自噬相关蛋白LC3-Ⅰ与LC3-Ⅱ的比例(P＜0.05）。 结论：①异丙酚可以增加缺氧复氧损伤细胞的活力和减少缺氧复氧损伤引起的细胞凋亡。②14个差异表达的MiRNAs参与异丙酚后处理减轻缺氧复氧损伤内皮细胞的过程，其中10个差异表达MiRNAs的靶蛋白为自噬相关蛋白，借此构建自噬信号通路调控网络，说明异丙酚可以通过抑制过度自噬来实现其对缺氧复氧损伤细胞的保护作用。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

综述 异丙酚后处理对缺血再灌注损伤影响的研究进展

致谢

附录一： 缩写词中英文对照

附录二：在读期间的科研情况