预测食管鳞状细胞癌淋巴结转移血清exosomal miRNAs的表达谱及诊断模型

摘要

本发明涉及食管鳞状细胞癌淋巴结转移血清exosomal特异表达miRNAs，其PCR检测引物，以及预测模型，属于医学诊断技术领域。食管鳞状细胞癌淋巴结转移血清exosomal miRNAs特异表达谱，包括上调的三种miRNAs及下调的miR‑432‑5p。本发明提出了食管鳞状细胞癌淋巴结转移血清exosomal miRNAs特异表达谱及相关检测引物；同时提出的血清exosomal miRNAs模型对淋巴结转移情况具有较高的预测效能，同时此模型也能够高效预测T1期食管鳞状细胞癌淋巴结转移情况。解决了淋巴结转移患者早期症状与体征并不明显，导致传统方法淋巴结转移预测异常困难的问题，为临床医生针对淋巴结转移的治疗方案准确实施提供可能，也为患者存活率的提高提供可能。

说明书

技术领域

本发明涉及食管鳞状细胞癌淋巴结转移血清exosomal特异表达miRNAs，其PCR检测引物，以及预测模型，属于医学诊断技术领域。

背景技术

食管癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，也是肿瘤性死亡的重要原因。而食管鳞状细胞癌是食管癌的主要病理类型，约占食管癌的90%。虽然食管鳞状细胞癌淋巴结转移患者可以通过手术联合放化疗或者靶向药物治疗进行干预，但淋巴结转移患者早期症状与体征并不明显，导致淋巴结转移预测异常困难，临床医生针对淋巴结转移的治疗方案无法准确实施，患者总体的五年生存率仍然不容乐观，仅仅17%左右。目前常用的检查手段，如影像学检查（数字CT）、血清肿瘤标志物（CEA、SCC等）等，因特异性差、敏感性不强、病人依从性差等原因存在各种不足。而肿瘤大小，分化程度，淋巴管和/或血管侵袭以及T分期等预测信息只能从术后病理结果中获得。因此，寻找一种新型非侵入性、高灵敏度和高特异性的预测标志物用于食管鳞状细胞癌淋巴结转移预测是当前的研究热点和难点。

MicroRNA(miRNAs)是一类长度18-26个核苷酸的非编码RNA，可通过靶向下游mRNA的3`-UTR区域调控靶基因的表达，进而参与肿瘤细胞分化、生长、代谢和凋亡等过程。已经有研究证实，miRNAs在肿瘤中异常表达，与肿瘤的发生、发展、转移和预后存在密切的联系。血清exosome中存在丰富且稳定的miRNAs，淋巴结转移组具有其特定的miRNAs表达谱，为淋巴结转移的无创性预测提供了新的可能性。但是目前为止,对食管鳞状细胞癌淋巴结转移血清exosomal miRNAs特异表达谱，以及差异表达miRNAs的筛选研究尚未有文献报道，对于食管鳞状细胞癌淋巴结转移血清exosomal miRNAs预测模型的建立尚处于空白期，该手段对淋巴结转移发生的早期预测尚未实现。

发明内容

本发明针对传统淋巴结转移预测异常困难，临床医生针对淋巴结转移的治疗方案无法准确实施的问题提出一种新型的预测食管鳞状细胞癌淋巴结转移血清exosomalmiRNAs的表达谱及诊断模型。

为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：

一种食管鳞状细胞癌淋巴结转移血清exosomal miRNAs特异表达谱，包括上调的三种miRNAs （chr 8-23234-3p、chr 1-17695-5p、chr 8-2743-5p）及下调的miR-432-5p。

miRNA序列如下：

（1）chr 8-23234-3p的5’-3’序列：GCAGGTCCCAAGGGTATG;

（2）chr 1-17695-5p的5’-3’序列：AAACCGGATGCCTACAAAC;

（3）chr 8-2743-5p的5’-3’序列：AGCTCTGGTGGAGTCGTC;

（4）miR-432-5p的5’-3’序列：TCTTGGAGTAGGTCATTGGGTGT。

上述食管鳞状细胞癌淋巴结转移血清exosomal miRNAs （chr 8-23234-3p、chr1-17695-5p、chr 8-2743-5p、miR-432-5p）的检测引物，如下：

（1）chr 8-23234-3p特异性检测引物的序列如为: GCAGGTCCCAAGGGTATG;

（2）chr 1-17695-5p特异性检测引物的序列为： AAACCGGATGCCTACAAAC;

（3）chr 8-2743-5p特异性检测引物的序列为: AGCTCTGGTGGAGTCGTC;

（4）miR-432-5p特异性检测引物的序列为: TCTTGGAGTAGGTCATTGGGTGT。

上述的引物在制备检测食管鳞状细胞癌淋巴结转移的试剂和/或试剂盒中的应用也是本发明的保护范围。

一种食管鳞状细胞癌血清exosomal miRNAs预测模型及预测方法。其中预测模型具体如下，运用以下公式计算：

Logit (P = LN metastasis) = 1.466*chr 8-23234-3p +0.815*chr 1-17695-5p +0.398*chr 8-2743-5p - 3.833*miR-432-5p - 0.292

公式中的chr 8-23234-3p、chr 1-17695-5p、chr 8-2743-5p、miR-432-5p分别表示相对应的miRNAs的相对表达量。

一种利用上述预测模型预测的方法，如下：首先，利用上述特异表达miRNAs的检测引物测定待诊断患者的血清exosome中四种miRNAs（chr 8-23234-3p、chr 1-17695-5p、chr8-2743-5p、miR-432-5p）的相对表达量，运用下述公式计算：

Logit (P = LN metastasis) = 1.466*chr 8-23234-3p +0.815*chr 1-17695-5p +0.398*chr 8-2743-5p - 3.833*miR-432-5p - 0.292

将四种miRNAs的表达量分别输入Medcale软件（该软件为所属领域的常规软件，为现有技术中已有的软件），若logit(P= LN metastasis)为1，可以判断为发生淋巴结转移；若logit(P= LN metastasis)为0，判断为未发生淋巴结转移。

本发明基于临床常规收集的食管鳞状细胞癌患者血清exosome样本筛查差异表达miRNAs的技术路径，对标本中miRNAs表达谱进行了比对分析，共筛查出17个差异表达miRNAs，序列见表1。对上述17个差异表达miRNAs在食管鳞状细胞癌患者血清exosome中的表达丰度进行研究，最终确定了与淋巴结转移相关的4个miRNAs，即上调的chr 8-23234-3p、chr 1-17695-5p、chr 8-2743-5p及下调的miR-432-5p且自主设计了其表达量检测的特异性引物，具体见表2。并在两个独立样本队列（训练组和验证组）中进行验证。进而，提供了一种预测食管鳞状细胞癌淋巴结转移的血清exosomal miRNAs表达模型，利用多元logistic回归方法提供了一种淋巴结转移血清exosomal miRNAs模型的计算公式：

Logit (P = LN metastasis) = 1.466*chr 8-23234-3p +0.815*chr 1-17695-5p +0.398*chr 8-2743-5p - 3.833*miR-432-5p - 0.292

ROC曲线分析显示，此血清exosomal miRNAs模型对淋巴结转移具有较高的预测效能，此模型能够预测食管鳞状细胞癌淋巴结转移患者。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明提出了食管鳞状细胞癌淋巴结转移血清exosomal miRNAs特异表达谱及相关检测引物；同时提出的血清exosomal miRNAs模型对淋巴结转移情况具有较高的预测效能，同时此模型也能够高效预测T1期食管鳞状细胞癌淋巴结转移情况。解决了淋巴结转移患者早期症状与体征并不明显，导致传统方法淋巴结转移预测异常困难的问题，为临床医生针对淋巴结转移的治疗方案准确实施提供可能，也为患者存活率的提高提供可能。

附图说明

图1：四种exosomal miRNAs在淋巴结转移组和对照组中的表达及预测ROC曲线，其中，A：训练组chr 8-23234-3p；B：训练组chr 1-17695-5p；C：训练组chr 8-2743-5p；D：训练组miR-432-5p；E：训练组chr 8-23234-3p；F：训练组chr 1-17695-5p；G：训练组chr 8-2743-5p；H：训练组miR-432-5p。

图2：四种exosomal miRNAs在淋巴结转移组和对照组中的表达及预测ROC曲线，其中，A：验证组chr 8-23234-3p；B：验证组chr 1-17695-5p；C：验证组chr 8-2743-5p；D：验证组miR-432-5p；E：验证组chr 8-23234-3p；F：验证组chr 1-17695-5p；G：验证组chr 8-2743-5p；H：验证组miR-432-5p。

图3：建立的诊断模型(panel)对淋巴结转移预测ROC曲线。其中，A：训练组Panel；B：验证组Panel。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

实施例1

1、研究对象

血清标本共来自经受试者同意的186例未发生淋巴结转移食管鳞状细胞癌患者（ESCC）和180例发生淋巴结转移食管鳞状细胞癌患者。所有ESCC患者来自山东大学第二医院和山东大学齐鲁医院胸外科住院患者，均为首次入院接受治疗的患者，入院前未曾接受任何药物或手术治疗，其分期和病理类型均经CT检查或术后病理检查确认。所有血清标本均在患者接受任何药物或手术治疗前取得。

2、标本采集

采集血清3 ml，立即4℃低温条件下，1600g离心5分钟，然后16000g离心10分钟，将分离上清液保存于-80℃待测。

3、RNA分离及提取

取冻存血清exosome样本于常温下解冻，按miRNeasy Micro Kit (QIAGEN, Valencia,CA, USA)试剂使用说明提取血清exosomal总RNA。

5、RT-qPCR

使用PrimeScript

PCR反应体系（25μl）：

模板DNA：2ul，

TB green Premix Ex Taq：12.5μl，

上游引物（10µM）：1μl，

随机引物（10µM）：1μl，

无菌水：8.5μl，

反应条件为：95℃ 30秒→1个循环；（95℃ 5秒，58℃ 30秒）→45个循环，每个标本均重复测定三次，miRNA表达量采用2

6、数据处理与统计学分析

通过SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析，使用Mann-Whitney U非参数检验比较两组样本间miRNAs的浓度差异，

7、检测结果

1）通过对淋巴结转移组与未发生淋巴结转移组的血清exosome样本进行高通量测序及筛选，共得到17个差异表达的miRNAs，包括chr 20-77445-5p、chr 1-17695-5p、chr X-14036-5p、miR-134-5p、chr 16-7678-3p、chr 2-13537-3p、miR-576-3p、chr 2-21198-3p、miR-493-5p、chr 8-4365-5p、chr 8-23234-3p、chr 18-28173-5p、chr 8-2743-5p、miR-432-5p、miR-654-3p、miR-382-5p、chr 5-9554-5p。序列如表1所示。

表1 测序筛出的差异miRNAs序列

2）上述17个miRNAs经RT-qPCR 验证，以平均Cq值小于35且检测率大于75%；在非小细胞肺癌组和对照组表达差异具有统计学意义，即

表2 引物序列

3）如图1所示，分别在两个独立研究队列（Training和Validation组）中进行检测分析，发现上调的chr 8-23234-3p、chr 1-17695-5p、chr 8-2743-5p及下调的miR-432-5p。建立上述4个miRNAs各自预测；淋巴结在转移的ROC曲线，如图1所示。

4）将上述4个miRNAs带入多元logistic回归分析，建立联合诊断模型。计算公式为：logit(P = LN metastasis) = 1.466*chr 8-23234-3p +0.815*chr 1-17695-5p +0.398*chr 8-2743-5p - 3.833*miR-432-5p - 0.292。经ROC曲线分析，此模型在训练组中对食管鳞状细胞癌淋巴结转移的预测效能AUC为0.865，敏感性和特异性分别为79.5%和82.1%，在验证组中对食管鳞状细胞癌淋巴结转移的诊断效能AUC为0.845，敏感性和特异性分别为77.3%和72.5%，如图3所示。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学第二医院

<120> 预测食管鳞状细胞癌淋巴结转移血清exosomal miRNAs的表达谱及诊断模型

<130> 1

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcaggtccca agggtatg 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaaccggatg cctacaaac 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agctctggtg gagtcgtc 18

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcttggagta ggtcattggg tgt 23

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcaggtccca agggtatg 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaaccggatg cctacaaac 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agctctggtg gagtcgtc 18

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tcttggagta ggtcattggg tgt 23