淡色库蚊/致倦库蚊对杀虫剂靶标抗性机制的研究

摘要

淡色库蚊(Culex pipiens pallens)和致倦库蚊(Cx.pipiens quinquefasciatus)同属于尖音库蚊复合组(Cx.pipiens complex),是我国主要的家栖蚊种,更是丝虫病和乙型脑炎的重要媒介。目前,化学防治仍为蚊虫综合防治的重要措施之一,拟除虫菊酯、有机磷和氨基甲酸酯三大类化学杀虫剂的广泛应用已经导致了淡色库蚊和致倦库蚊抗药性的发生和发展。有报道我国不同地区淡色库蚊和致倦库蚊对多种杀虫剂均产生了不同程度的抗性,因此迫切需要对杀虫剂抗性的发生和发展进行深入研究。本研究以野外采集的淡色库蚊和致倦库蚊种群为研究对象,测定其生物抗性,并对其靶标基因乙酰胆碱酯酶基因和钠离子通道基因的突变进行了研究,分析基因突变频率与生物抗性之间的相关性,了解蚊虫种群与抗性相关的基因突变的现状,为蚊虫抗性治理提供新的靶标。本研究的主要结果如下:
　　1.淡色库蚊和致倦库蚊自然种群抗性水平检测结果
　　通过LC50的生物测定,发现各地理株蚊虫对不同类型杀虫剂均产生了一定的抗药性。5株致倦库蚊幼虫对敌敌畏的抗性倍数介于2.8-17.6倍;对残杀威的抗性倍数介于2.4-11.0倍;6株致倦库蚊幼虫对溴氰菊酯的抗性倍数介于9-1019倍;对高效氯氟氰菊酯的抗性倍数介于14-1291倍。7株淡色库蚊和4株致倦库蚊成蚊对溴氰菊酯和氯菊酯的抗性均达到抗性水平。
　　2.致倦库蚊靶标抗性基因上存在的基因突变
　　通过分子克隆技术,发现自然种群致倦库蚊乙酰胆碱酯酶基因中存在5个基因突变,分别是V185M:GTG→ATG,G247S:GGC→AGC,A328S:GCC→TCC,A391T:GCC→ACC,T682A:ACA→GCA;钠离子通道基因存在6个位点上的7种基因突变,分别是V250M:GTG→ATG,R436K:AGG→AAG,M943V:ATG→GTG,I973T:ATC→ACA,L1035F:TTA→TTT,L1035S:TTA→TCA,E1901D:GAG→GAT。另外,在钠离子通道上共发现11处可变剪接,这些可变剪接在丰富钠通道蛋白多样性方面也许会有一定的意义,但与拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性关系有待进一步研究。
　　3.致倦库蚊靶标抗性基因突变频率的计算
　　通过基因测序,计算出各个位点基因突变的突变频率分别是:乙酰胆碱酯酶基因上的V185M:6.10％-25.0%,G247S:0.00%-18.1%,A328S:2.90%-47.2%,A391T:0.00%-54.3%,T682A:18.6%-51.6%;钠离子通道上的V250M:17.2%-33.9%,R436K:46.3%-50.0%,M943V:25.8%-41.9%,I973T:24.2%-35.5%,L1035F:28.8%-74.3%,L1035S:3.13%-21.2%,E1901D:8.33%-44.7%。
　　4.致倦库蚊靶标抗性基因突变频率与抗性的相关性研究
　　相关性分析表明,乙酰胆碱酯酶基因上的V185M突变的RS基因型频率与残杀威抗性呈显著的正相关关系(P<0.05),G247S和A328S突变与残杀威抗性也呈正相关。而T682A突变与残杀威抗性呈显著的负相关(P<0.05)。说明乙酰胆碱酯酶基因上的V185M、G247S和A328S突变与残杀威抗性存在一定的关系。钠离子通道基因上的L1035F/S突变与溴氰菊酯和高效氯氟氰菊酯抗性呈显著或极显著的正相关,说明 L1035这个位点的突变与溴氰菊酯和高效氯氟氰菊酯抗性均有一定的关系。此外,对杀虫剂抗性相关性研究表明,致倦库蚊对溴氰菊酯与高效氯氟氰菊酯两种杀虫剂存在极显著的交互抗性(P<0.01)。
　　5.致倦库蚊靶标抗性基因突变的哈迪-温伯格平衡检测和基因突变的连锁分析
　　哈迪-温伯格平衡检测结果表明,乙酰胆碱酯酶基因上的5个突变均未偏离哈温平衡,而钠离子通道基因上的6个突变点中有4个偏离哈温平衡(R436K,M943V,I973T和L1035F/S),另外两个(V250M和E1901D)未偏离哈温平衡。连锁不平衡分析表明,乙酰胆碱酯酶基因上的V185M与A328S和A391T突变存在显著的连锁关系,钠离子通道基因上的M943V和I973T存在极显著的连锁关系。
　　综上,本研究发现了不同地理株淡色库蚊和致倦库蚊对杀虫剂已经产生了不同程度的抗药性,并且发现了与抗性相关的经典基因突变G247S和L1035F/S以及新的抗性相关基因突变V185M和A328S,建立了突变检测和与抗性相关性的分析方法。这为蚊虫抗性治理提供了理论依据,为抗药性检测提供了新的方法。

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英文摘要

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果

3.1淡色库蚊和致倦库蚊对常用杀虫剂抗性的生物测定

3.2致倦库蚊抗性靶标乙酰胆碱酯酶基因的研究

3.3致倦库蚊抗性靶标钠离子通道基因的研究

4 讨论

4.1淡色库蚊和致倦库蚊对常用杀虫剂的抗药性

4.2 致倦库蚊乙酰胆碱酯酶基因突变与抗性的关系

4.3 致倦库蚊钠离子通道基因突变与抗性的关系

5 结论

参考文献

附录：

致谢

综述