马钱子碱对人肺癌细胞株PC-9凋亡及周期影响的研究

摘要

目的:
　　1、观察马钱子碱对人肺癌细胞株PC-9生长和增殖的影响；
　　2、采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测马钱子碱对人肺癌细胞株PC-9凋亡的影响，并初步探讨其机制；
　　3、采用PI染色法观检测马钱子碱对人肺癌细胞株PC-9周期的影响，并初步探讨其机制。
　　方法：
　　1、以人肺癌细胞株PC-9为研究对象，将其分为4组：空白对照组、DMSO对照组（2‰）、150μM马钱子碱组、300μM马钱子碱组，体外培养PC-9细胞，采用Cell Titer-Glo发光法、平板克隆形成实验及EdU（5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷）掺入法观察该药对PC-9细胞生长和增殖的影响；
　　2、采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测各组体外培养细胞凋亡率，PI单染法检测各组PC-9细胞周期比例；
　　3、采用RT-PCR法检测马钱子碱对各组体外培养细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表达水平的影响，采用实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测各组细胞周期相关基因CyclinD1、CyclinE mRNA的表达水平，蛋白印迹法（Western blotting）检测细胞凋亡及周期相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3、CyclinD1、CyclinE蛋白的表达。
　　结果：
　　1、马钱子碱可以抑制人肺癌细胞株PC-9的生长和增殖，并呈时间-浓度依赖性，且与对照组相比，各组差异均有统计学意义（P<0.05）。Cell Titer-Glo发光法显示：高浓度马钱子碱组（800μM）在24h、48h、72h对PC-9细胞抑制率分别达到了63％、89%、96%；平板克隆形成实验结果显示：150μM马钱子碱组、300μM马钱子碱组抑制PC-9细胞克隆形成率分别为58%、88%；EdU掺入法结果显示：150μM马钱子碱组、300μM马钱子碱组抑制PC-9细胞EdU阳性率（%）分别为：18%、55%。2、流式结果显示马钱子碱可以诱导PC-9细胞凋亡，且与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05)；PI染色法结果显示马钱子碱对细胞周期的影响主要是阻滞PC-9细胞于G0/G1期，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.01)；
　　3、RT-PCR、q RT-PCR和Western blotting结果显示：随着马钱子碱浓度的增加，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA和蛋白表达明显降低,，而促凋亡基因Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表达均明显升高；而细胞周期相关基因CyclinD1、CyclinE mRNA和蛋白的表达水平则随着马钱子碱浓度的提高而降低。
　　结论：
　　1、马钱子碱可以抑制人肺癌细胞株PC-9的生长和增殖；
　　2、马钱子碱可以诱导人肺癌细胞株 PC-9凋亡，其分子机制可能与激活 Bax、Caspase-3和抑制Bcl-2等凋亡调控基因有关；
　　3、马钱子碱阻滞人肺癌细胞株PC-9于G0/G1期，机制主要与其通过下调Cyclin D1、Cyclin E表达有关。

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1 引言

2 材料

2.1 实验室

2.2实验细胞株

2.4 实验药品

2.5 实验试剂

2.6 实验仪器及设备

3 方法

3.1马钱子碱（Brucine）药物的配制方法：

3.2 RPMI-1640培养基的配制

3.3 细胞培养与传代

3.4细胞冻存

3.5细胞复苏

3.6 细胞计数及活力测定

3.7CellTiter-Glo发光法(The CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay)检测细胞活力

3.8细胞平板克隆形成实验（Colony formation assay）检测细胞克隆形成能力

3.9 EdU掺入法检测细胞增殖

3.10AnnexinV-FITC /PI双染流式细胞术检测细胞凋亡

3.11 PI染色检测细胞周期

3.12 RNA的提取、逆转录

3.13RT-PCR检测Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA的表达

3.14实时荧光定量PCR检测CyclinD1、CyclinE mRNA的表达

3.15Western blotting检测蛋白表达

3.16 统计学方法

4 结果

4.1马钱子碱对人肺癌细胞株PC-9生长和增殖抑制作用

4.2 马钱子碱对人肺癌细胞株PC-9凋亡的影响

4.3 马钱子碱对人肺癌细胞株PC-9凋亡相关基因Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的影响

4.4 马钱子碱对人肺癌细胞株PC-9周期的影响

4.5 马钱子碱对人肺癌细胞株PC-9周期相关蛋白CycliD1、CyclinE表达的影响

附图：

5 讨论

5.1 马钱子碱对人肺癌细胞株PC-9的生长抑制作用

5.2 马钱子碱诱导人肺癌细胞株PC-9凋亡及其初步机制

5.3 马钱子碱阻滞人肺癌细胞株PC-9于G0/G1期及其初步机制

6 结论

参考文献

附录

致谢

综述: 中药马钱子碱抗肿瘤作用的实验研究进展