蛋白质组学是系统鉴定和定量蛋白质,并研究蛋白质功能的新兴学科。随着技术的进步和研究的深入,蛋白质组学在生命科学研究中得到了迅速的发展和推广,并逐渐成为生命科学研究的有力支柱。在蛋白质组学定量研究中,基于稳定同位素标记氨基酸的细胞培养(stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC)技术的定量蛋白质组学因灵敏度高、精度好,成为定量蛋白质组学的金标准。但SILAC研究成功开展的前提是蛋白质组SILAC全标记定量内标的制备。国际上通用的办法是经过7代以上的培养来获取,制备的周期长、费用高,标记效率还受细胞类型、状态等的影响,制备的细胞还难于实现完全标记。本研究以肝癌细胞系MHCC97-L为对象,系统研究并开发了液氮冻存SILAC种子细胞的技术体系,实现了快速、经济、高效、完全标记的SILAC内标制备。SILAC标记并且冻存的细胞经两天的复苏培养后便可重新获得和普通培养条件一致的高质量的SILAC标记的细胞,细胞的标记效率在97％以上。SILAC细胞与正常培养条件下的细胞相比,其细胞形态、大小及倍增时间均没有明显变化。定量比较SILAC标记的细胞在冻存前以及冻存复苏后的蛋白质表达谱,我们发现这两种状态的蛋白质组无可见的差异。这为基于SILAC的定量蛋白质组学研究提供了支撑。 磷酸化修饰是细胞中最为丰富、调控作用最为重要的一种蛋白质翻译后修饰形式,在细胞正常生命活动和疾病的发生、发展中扮演了重要作用。尽管磷酸化蛋白质组学研究是蛋白质翻译后修饰研究中最为成熟,通量最高的技术,但其研究的深度还受制于磷酸化肽段的富集,至今难于全景式的揭示细胞中蛋白质组的磷酸化状态。我们系统调查了IMAC(immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)磷酸化肽亲和介质与肽段的比例对磷酸化肽段富集的影响,发现用10μl5%IMAC磷酸化肽亲和介质可从80-93μg肽段样品中富集2000多个磷酸化肽段,磷酸化富集效果最好,富集效率可以达到90%以上。研究进一步揭示单磷酸化肽段和多磷酸化肽段之间存在竞争,影响了多磷酸化肽的鉴定。我们利用多次级联富集策略在降低样品复杂度的同时,提高了磷酸化肽段尤其是多磷酸化肽段的鉴定能力。整合这些技术,我们利用肽段的高pH液相分离、级联富集方法和液相色谱-质谱联用分析,从HCCLM6这一个肝癌细胞系鉴定到了35,032个磷酸化肽,实现了磷酸化蛋白质组的高覆盖鉴定。这是目前国际上单一样本鉴定磷酸化肽的最高数据集,不仅推动了磷酸化蛋白质组学的发展,而且还为磷酸化蛋白质组的功能研究创造了条件。
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