PHLPP2基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及对舌癌细胞Tca8113增殖的影响

摘要

目前，口腔癌中发病率最高的是舌癌，舌癌有很高的恶性程度，早期即可检测到淋巴结转移，术后较易复发且生存质量较差，往往对患者的生命造成很大的威胁。近年来，由于人类对舌癌越来越重视，使其各项研究方面都取得了一定的成果，但舌癌患者的5年生存率一直停滞中间偏下水平上，主要由于早期特异性生物学标志物的缺乏及舌癌易转移复发等原因导致。由于舌是人体一个重要的功能器官，因此，如何延长舌癌患者的生存寿命，提高患者术后的生存质量，是舌癌探索方面的研究重点。
　　PHLPP是一种蛋白激酶，具有抑制恶性肿瘤形成的功能，是一个典型的抑癌基因。当PHLPP被激活时，PHLPP对蛋白磷酸酶Akt发生去磷酸化作用，导致细胞内某些信号通路的传导受影响。PHLPP2是PHLPP的一种异构体，其缺失与许多疾病有关，尤其在一些恶性肿瘤中，若PHLPP2发生了不同程度的缺失，会造成恶性肿瘤细胞增殖的增加，细胞凋亡的减少，但是PHLPP2在恶性肿瘤细胞是如何发挥作用并不十分明了，特别是在舌癌中的具体机制仍需继续研究。细胞内有一个重要的通路是磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（phosphatidyl-inositol3-kinase/serine-threonine kinase,PI3K/AKT）信号传导通路，其主要是通过激活Akt影响下游多种效应分子的活化状态发挥作用。Akt是该通路的中心环节，在该信号通路中作用举足轻重，影响细胞的各个功能，与多种恶性肿瘤的发生发展紧密相关。Akt的致癌作用主要与其Ser473位点上磷酸化相关,有研究表明Akt活性在恶性肿瘤细胞的增殖、转移及对放化疗拮抗中所起的作用都非常关键。
　　本次实验在不同水平上研究了PHLPP2及Akt Ser473在舌癌中的作用，并得到了一些有意义的结果，对舌癌的发生发展进行了一些有益的探索。本实验首先构建稳定表达PHLPP2 shRNA的Tca8113细胞系，研究敲低PHLPP2对Akt Ser473磷酸化水平和Tca8113细胞生长的影响。利用RNAi干扰技术，设计并合成针对PHLPP2基因的shRNA，并将其克隆到shRNA表达载体PSIH-H1上。经测序成功后，包装病毒并感染舌癌细胞Tca8113，建立敲低PHLPP2的稳定细胞株。通过实时定量PCR和Western blot实验检验RNAi的干扰效果。利用Western blot实验和细胞生长曲线检测敲低PHLPP2对Akt Ser473磷酸化及细胞生长的影响。经测序证明，成功构建PHLPP2 shRNA真核表达载体。实时定量PCR和 Western blot实验证明，构建的shRNA能有效的抑制PHLPP2的表达，并构建敲低PHLPP2基因的Tca8113稳定细胞系。实验表明，敲低PHLPP2可促进细胞的生长并升高Akt Ser473的磷酸化水平。成功构建PHLPP2基因的shRNA真核表达载体，转染细胞后能有效地抑制PHLPP2基因的表达，且能升高Akt Ser473的磷酸化水平并促进细胞的生长，为进一步研究PHLPP2在舌癌中的功能及机制奠定基础。

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1 前言

1.1舌癌的发展概况

1.2蛋白磷酸酶Akt的概述及研究进展

1.3 PHLPP2基因的概述及对AKT的作用

2 材料和方法

2.1材料

2.2方法

3 结果

3.1 PHLPP2shRNA载体构建及靶序列测序分析

3.2 PHLPP2 shRNA对PHLPP2 mRNA的影响

3.3 PHLPP2shRNA对PHLPP2蛋白表达水平及Akt Ser473磷酸化的影响

3.4 PHLPP2 shRNA对Tca8113细胞生长的影响

4讨论

5结论

参考文献

7附录

致谢

综述:舌癌的研究现状