不同浓度褪黑素对ICSI周期中未成熟卵子体外培养成熟及后续胚胎发育的影响

摘要

目的：
　　1．将不同浓度的褪黑素加入IVM培养液中，培养ICSI周期中人未成熟卵母细胞，探索不同浓度褪黑素对人类未成熟卵母细胞体外成熟以及后续胚胎发育的影响。2.根据对加有褪黑素的IVM液中培养成熟的卵母细胞线粒体膜电位与不加褪黑素培养成熟的卵母细胞线粒体膜电位的分析，初步探索褪黑素在人未成熟卵体外培养成熟中的作用机制。
　　方法：
　　1.将来自于ICSI周期中的602枚未成熟卵子随机加入含有不同浓度褪黑素的IVM液中进行培养，培养24h后对成熟的卵母细胞行ICSI受精，ICSI后16-18h观察受精情况，挑选出正常受精卵进行囊胚培养。根据在 IVM液中所加褪黑素浓度的不同，实验分为6组（0，10-11M,10-9M,10-7M,10-5M,10-3M），未加褪黑素组为对照组，其余5组为实验组。比较每组中卵子的成熟率，受精率，卵裂率，囊胚形成率以及优质囊胚形成率情况。并且通过aCGH技术对优质囊胚的染色体进行检测，判断非整倍体发生概率。2．将来自对照组中经过 IVM培养成熟的13枚卵子和MT=10-5M组中IVM成熟的15枚卵子进行线粒体膜电位的检测。用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒将成熟的卵母细胞的线粒体膜电位进行染色，在倒置荧光显微镜下，分别在红色荧光和绿色荧光模块下进行观察，及时拍照。然后用 Image J软件测量同一卵母细胞的红色荧光和绿色荧光强度值，得到二者荧光强度比值，通过红绿荧光强度比值来反应线粒体膜电位强度。
　　结果：
　　1.与对照组相比，10-9M,10-7M,10-5M组优质囊胚率均显著增高（75±4.4％，63.5±5.4%，60±4.7% VS11.1±5.4%,p<0.05），且10-9M组优质囊胚形成率最高。与对照组相比，10-3M组卵裂率及囊胚形成率均显著降低（73.8±1.2%VS.90.2±0.6%；2±0.2% VS.16.4±0.6%；p<0.05）。本研究共获得30枚优质囊胚，随机选取11枚优质囊胚行aCGH检测（1枚来自对照组，10枚来自实验组），对照组中1枚优质囊胚为非整倍体，核型为49，XX（+1，+15，+17）；另外实验组中2枚胚胎染色体异常，分别为46，XX(+11，-15)（10-11M组）；和46，XX（-7(q36.2～q36.3)）（10-7M组），其余8枚(4枚来自10-9组，1枚来自10-7组，2枚来自10-5组，另1枚来自10-11组)均为正常胚胎。2.与对照组相比，10-5M组成熟卵母细胞线粒体膜电位荧光强度比值明显增高（0.58±0.3 VS.0.35±0.17，P<0.05）。
　　结论：
　　1.在IVM培养液中加入合适浓度的褪黑素能改善 ICSI周期中人未成熟卵母细胞的 IVM结果，获得更多的染色体正常的优质囊胚，其中最佳褪黑素浓度为10-9mol/l。2.合适浓度褪黑素在一定程度上可以改善卵母细胞的质量。

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中英文缩略词表

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英文摘要

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 卵母细胞和精子来源

2.1.2 仪器及耗材

2.1.3 实验试剂及配制

2.2 方法

2.2.1 未成熟卵母细胞的募集

2.2.2 实验设计

2.2.3 人未成熟卵子的体外成熟，受精及胚胎的发育

2.2.4 囊胚的评分

2.2.5 囊胚的冷冻

2.2.7 优质囊胚的aCGH检测

2.2.8 对MII期卵子进行线粒体膜电位检测

2.2.9 统计学方法

3 结果

3.1 每组中人未成熟卵子体外成熟率，受精率，卵裂率，囊胚形成率，优质囊胚形成率结果的比较

3.3 aCGH检测结果

3.4 成熟卵母细胞线粒体膜电位检测结果

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

综述:微阵列比较基因组杂交技术及其在胚胎植入前遗传学诊断中的应用