Paralemmin-3在内毒素诱导的急性肺损伤中的作用及其机制研究

摘要

研究目的：构建靶向大鼠paralemmin-3(PALM3)基因的短发夹RNA(shRNA)重组腺病毒载体，以所构建的重组腺病毒载体感染大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞和大鼠，在体内和体外实验中探讨PALM3在LPS诱导的急性肺损伤中的作用；同时利用免疫共沉淀检测 LPS刺激后 PALM3是否与 TLR4信号通路中的接头分子 MyD88、TICAM-2、IRAK-1、TRAF-6存在相互作用，以探讨下调PALM3表达对急性肺损伤保护作用的分子机制。
　　研究方法：
　　1.靶向大鼠PALM3基因的shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定
　　按RNAi设计原则，分别设计3条针对大鼠PALM3基因的shRNA，插入穿梭质粒pGV120-EGFP，并行PCR、测序鉴定，采用AdMAXTM包装系统将穿梭质粒pGV120-EGFP和骨架质粒pBHGlox-E1，3Cre共转入包装293细胞中，包装出靶向大鼠 PALM3基因 shRNA重组腺病毒载体 Ad.PALM3-shRNA-1， Ad.PALM3-shRNA-2，Ad.PALM3-shRNA-3，扩增并纯化重组腺病毒后采用TCID50法测定病毒滴度。通过酶消化法分离大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)，经差速离心和免疫黏附法纯化AECⅡ，进行原代培养并采用肺表面活性物质相关蛋白C(SP-C)对 AECⅡ鉴定。针对不同 PALM3靶序列的重组腺病毒(Ad.PALM3-shRNA-1， Ad.PALM3-shRNA-2，Ad.PALM3-shRNA-3)分别转染 AECⅡ细胞，荧光显微镜下观察转染效率并确定感染复数(MOI)值，Western Blot检测AECⅡ中PALM3蛋白的表达水平，评价三组重组腺病毒的干扰效率，选择干扰效率最佳的重组腺病毒用于后续实验。
　　2.干扰PALM3表达对大鼠内毒素性急性肺损伤的保护作用
　　依据第1部分实验结果，选择干扰效率最佳的Ad-PALM3-shRNA-1用于后续实验。用经鼻滴注的方法，以3×108PFU/只的剂量的建立大鼠重组腺病毒Ad.PALM3-shRNA感染模型组（ Ad.PALM3-shRNA组），同时用空病毒载体Ad-EGFP（Ad.EGFP组）和PBS（Control组）作为对照。感染48h后，以LPS(10mg/kg)腹腔注射复制内毒素性急性肺损伤模型。在LPS刺激后的0h、3h、6h、12h、24h和48h各时间点分别用RT-PCR和Western Blot检测PALM3 mRNA和蛋白表达情况；同时对比各组间的肺组织病理改变以及模型大鼠的7d存活率的变化；用ELISA法分别检测各组肺泡灌洗液中和血清中的 TNF-α、IL-1β、IL-6及 MPO表达水平的变化；用ELISA法检测肺组织匀浆中核转录因子NF-κB的活性变化。
　　3.干扰PALM3表达抑制LPS诱导的大鼠AECⅡ细胞炎症反应
　　依据第1部分实验结果，选择干扰效率最佳的Ad-PALM3-shRNA-1用于后续实验。以大鼠AECⅡ细胞为实验对象，实验共分为3组：Ad.PALM3-shRNA组(转染重组腺病毒Ad.PALM3-shRNA-1)，Ad.EGFP组(转染空腺病毒载体Ad.EGFP)及Control组(加入等体积PBS)。转染48h后，3组细胞均给予LPS(10μg/mL)刺激， LPS刺激后0h，3h，6h，12h，24h，48h收集细胞和细胞上清液，分别应用Western Blot及PCR检测三组细胞中PALM3蛋白和mRNA表达水平，用ELISA法分别检测各组细胞上清液中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平及细胞内核转录因子NF-κB活性。
　　4.验证PALM3是否与LPS-TLR4信号转导通路中的接头分子存在相互作用
　　同前原代培养大鼠 AECⅡ细胞，实验分为两组：1组给予 LPS10μg/mL(LPS组)，另1组加入等体积PBS(PBS组)，刺激24h后，提取细胞总蛋白，用WesternBlot法验证两组AECⅡ细胞中PALM3、MyD88、TICAM-2、IRAK-1、TRAF-6蛋白含量；用免疫共沉淀方法(CO-IP)验证PALM3是否与LPS-TLR4信号转导通路中的接头分子MyD88、TICAM-2、IRAK-1、TRAF-6存在相互作用。
　　研究结果：
　　1.成功构建了三组靶向大鼠 PALM3基因 shRNA的重组腺病毒载体：Ad.PALM3-shRNA-1、Ad.PALM3-shRNA-2、Ad.PALM3-shRNA-3，感染滴度分别是3×1010pfu/ml、2×1010pfu/ml和3×1010pfu/ml，均符合实验要求；AECⅡ细胞原代培养成功，细胞生长状态良好，经 SP-C免疫荧光鉴定成功。重组腺病毒转染AECⅡ后24h可见绿色荧光表达，48h荧光强度最高，最佳MOI值为200。三组重组腺病毒以相同MOI值转染AECⅡ48h后，与正常细胞及空白对照组相比，抑制PALM3蛋白表达被抑制，其中 Ad.PALM3-shRNA-1的干扰效率最佳备选用于后续实验。
　　2.正常大鼠肺组织中存在PALM3的表达，LPS诱导大鼠急性肺损伤模型中肺组织内PALM3的表达增加。与Control组及Ad.EGFP组相比，Ad.PALM3-shRNA组LPS腹腔注射后各时间点大鼠肺内PALM3的表达下调(P<0.05)；与Control组及Ad.EGFP组相比，Ad.PALM3-shRNA组大鼠肺组织的病变减轻、血清中及肺泡灌洗液中炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6及MPO表达水平下降、肺组织中NF-κB活性降低、肺损伤大鼠7d存活率显著提高(P<0.05)。
　　3.给予内毒素刺激后，随着作用时间的延长，大鼠AECⅡ中的PALM3的表达增加，重组腺病毒Ad.PALM3-shRNA转染后成功下调AECII中PALM3的表达（P<0.05）；给予LPS刺激后，与Ad.EGFP组和Control组相比，Ad.PALM3-shRNA组细胞炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量减少，核转录因子NF-κB的活性受抑（P<0.05）。
　　4.在AECII细胞中给予LPS刺激与否，均存在PALM3、MyD88、TICAM-2、IRAK-1、TRAF-6五种蛋白的表达；CO-IP结果证实PALM3与IRAK-1存在天然相互结合，并不依赖于LPS刺激，而给予LPS刺激后，在大鼠ACEⅡ中PALM3能以配体依赖的方式与TIACM-2、TRAF-6相互结合。
　　结论：
　　1.干扰 PALM3表达能减轻内毒素诱导的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞炎症反应，对内毒素性大鼠急性肺损伤具有保护作用；
　　2. PALM3可能是参与LPS-TLR4信号通路转导的关键接头分子之一，下调PALM3表达对ALI的保护作用可能是通过阻碍LPS-TLR4信号通路转导而实现的。

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前言

第一部分 靶向大鼠PALM3基因的shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

1. 材料

2.实验方法

3.结果

4.讨论

小结

第二部分 干扰PALM3表达对大鼠内毒素性急性肺损伤的保护作用

1.材料

2.实验方法

3．结果

4.讨论

小结：

第三部分 干扰PALM3表达抑制内毒素诱导的大鼠AECⅡ细胞炎症反应及其机制研究

1. 材料

2.实验方法

3.结果

4.讨论

小结：

全文总结

参考文献

附录

致谢

综述:Toll样受体4信号传导通路在急性肺损伤发病机制中的作用