血管紧张素Ⅱ1型受体在内毒素诱导急性肺损伤中的作用与初步机制

摘要

一、研究背景 :脓毒症(sepsis)是外科学和危重病医学中极为常见的一种并发症，肺脏是脓毒症时最易受损的器官之一。急性肺损伤(acute lung injury，ALI)主要表现为：低氧血症、通气-血流屏障障碍、肺水肿、肺部炎症甚至呼吸困难。促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β等被认为是激活细胞级联反应的主要介质，在急性肺损伤的发生发展中起重要作用。 血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)是肾素-血管紧张素系统(RAS)的主要活性物质，其作用主要体现在调节血管张力、血流及促进细胞生长、增生等方面。在哺乳动物里，将Ang Ⅱ受体主要分为血管紧张素Ⅱ 1(AT1)和2(AT2)型两种受体。目前已知的Ang Ⅱ的生理作用大部分是通过AT1体介导的。AT1受体的拮抗剂被广泛用于治疗高血压、心血管和肾脏疾病。近年来发现AngⅡ还具有另一重要功能-致炎作用。它可引起血管通透性的增加，诱导调节细胞因子、化学趋化因子和黏附分子等多种炎症介质的产生。新近研究发现，AT1受体拮抗剂能抑制诸如TNF-α、IL-6、IL-8、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、E-选择素等细胞因子和黏附分子，在动脉粥样硬化、风湿性关节炎和肾炎等疾病中具有一定的治疗作用。然而有关AT1受体在急性肺损伤中的作用，尚未见文献报道。 本实验的研究目的有二：一是观察AT1受体在内毒素诱导ALI中的作用。二是探讨AT1受体拮抗剂对促炎性细胞因子产生和核因子活化的影响。期望通过上述研究进一步认识急性肺损伤的发生机制，为其防治提供新的思路和方法。 二、研究目的:1.通过观察AT1受体拮抗剂ZD7155对内毒素诱导ALI小鼠肺组织促炎性细胞因子TNF-α和IL-β产生的影响，了解拮抗AT1受体对急性肺损伤的保护作用。 2.观察ZD7155对血管紧张素Ⅱ受体和核转录因子变化的影响，探讨AT1受体在内毒素诱导急性肺损伤中作用的初步机制。 三、研究内容:第一部分血管紧张素Ⅱ1型受体在内毒素诱导急性肺损伤中的作用24只BABL/C小鼠，随机分为正常对照NS组、LPS组、LPS＋ZD 7155组，每组8只。用1％戊巴比妥钠60 mg/kg行腹腔注射麻醉，仰卧固定消毒后，颈部正中切口逐层暴露气管，以静脉穿刺针经环甲膜向心端刺入气管，LPS组小鼠将LPS溶液(2 mg/kg)在缓慢滴入气管中，拔出穿刺针，将小鼠直立旋转，使药液在肺内分布均匀，缝合切口后观察。正常对照组小鼠进行相同麻醉和穿刺，以等量生理盐水替代LPS。LPS＋ZD 7155组小鼠在滴注内毒素前30分钟腹腔注射ZD7155(10 mg/kg)。24 h后经心脏取血处死，留取肺脏标本，测定肺脏含水量，作肺脏病理学检查和肺组织TNF-α和IL-1βmRNA检测。 第二部分血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂ZD 7155对内毒素诱导急性肺损伤小鼠肺脏核因子活化的影响88只BABL/C小鼠，随机分为正常对照NS组8只、LPS组40只、LPS＋ZD7155组40只，各组处理同第一部分实验，LPS和ZD 7155预处理组于致伤后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h等5个时相点经心脏取血处死动物。留取肺脏标本，采用Westernblot法检测肺脏AT1和AT2蛋白的表达，EMSA法检测核因子AP-1和NF-kB活性的改变，并采用免疫组化的方法判断AT1表达。 四、研究结果:第一部分小鼠气道内滴注2mg/kg的LPS后24h肺脏含水量较正常生理盐水组明显升高(81.08±1.78％vs75.83±1.27％，P<0.01)，组织病理学检查显示：肺脏出现明显的病理损害，同时肺脏TNF-α和IL-1β mRNA表达均显著增强(0.654±0.08 vs0.10±0.02，P<0.01；0.73±0.11 vs 0.09±0.02，P<0.01)，使用AT1受体拮抗剂ZD7155后肺脏含水量明显下降(79.06±2.36％vs81.08±1.78％，P<0.05)，肺脏的病理损害显著减轻，同时肺脏TNF-α和IL-1β mRNA表达均明显下降(0.29±0.05vs0.65±0.08P<0.05：0.314±0.07 vs 0.73±0.11 P<0.05)。第二部分正常NS对照组小鼠肺组织中肺泡内吞噬细胞和内皮细胞表达少量的AT1受体蛋白，在LPS致伤1 h、3 h后肺泡壁细胞和吞噬细胞、多形核白细胞等炎症细胞上表达AT1受体蛋白，LPS致伤6 h后，AT1表达于整个内皮细胞床和间质性吞噬细胞。伤后12 h、24 h，AT1受体蛋白仍表达于上述肺泡细胞，表达量有所下降。Western blot结果显示，与正常NS对照组相比较，用LPS滴注刺激后6h和24h的肺组织中AT1受体蛋白表达显著升高，其与内参照β-actin表达的相对比值分别为3.44:0.72和2.37:1.26(P均<0.01)。LPS＋ZD 7155组AT1蛋白表达显著低于LPS致伤组，其相对比值分别为1.90:3.44和153：2.37(P均<0.01)。另外，LPS致伤组6h、24 h的AT2受体蛋白表达显著低于正常NS对照组，其相对比值分别为0.76:1.31和0.64:1.80 (P均<0.01)。LPS＋ZD 7155 AT2蛋白表达显著高于LPS组，其相对比值分别为1.09:0.76和1.29:0.64(P均<0.01)。EMSA结果显示：NF-kB和AP-1的活化分别在LPS刺激后3 h和6 h达到最高峰。LPS刺激3 h、6 h后，肺组织细胞核中的NF-kB(52.33±4.8 vs 5.47±0.5，42.78±4.1vs5.47±0.5 P<0.05)和AP-1(61.14±5.7 vs 2.53±0.2，73.25±7.1 vs 2.53±0.2 P<0.05)活性都显著高于正常NS对照组，预先使用ZD 7155能显著抑制LPS刺激后肺组织的NF-kB活性(20.53±2.4 vs 52.33±4.8，18.51±1.7vs42.78±4.1 P<0.05)和AP-1活性的升高(17.56±1.6 vs 61.14±5.7，21.54±2.2 vs 73.25±7.1 P<0.05)。 五、研究结论: 1.AT1受体介导了肺脏促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的产生，在内毒素诱导急性肺损伤的发生中起重要的调控作用。 2.AngⅡ通过与AT1受体的结合，引起肺脏核因子NF-kB和AP-1的活化和促炎性细胞因子的产生，介导了内毒素诱导的AL1的发生。急性肺损伤

目录

论文说明：缩写对照表

声明

前 言

第一部分血管紧张素Ⅱ1型受体在内毒素诱导急性肺损伤中的作用

1材料和方法

2结果

3讨论

第二部分血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂ZD 7155对内毒素诱导急性肺损伤小鼠肺脏核因子活化的影响

1材料与方法

2结果

3.讨论

全文小结

附录:个人简历

发表论文一

发表论文二

致 谢

综述 血管紧张素Ⅱ在脓毒症炎症反应中作用的研究进展