不同年龄和性别影响对乙酰氨基酚急性肝损伤敏感性差异的机制研究

摘要

背景/目的：
　　对乙酰氨基酚（APAP）是临床上儿童常见的解热镇痛药物，其过量或不当使用引起的急性肝脏损伤是儿童药物性肝损伤的常见原因之一。然而，目前关于儿童和成人之间APAP急性肝损伤是否存在差异报道甚少。既往研究表明APAP在肝细胞内经P450代谢酶CYP2E1代谢生成有毒产物N-乙酰对苯醌亚胺（NAPQI），耗竭胞内还原型谷胱甘肽（GSH）进而引起氧化应激、线粒体功能障碍并最终导致肝细胞死亡。近期研究提示，APAP急性肝损伤过程发生二次打击，TLR4信号可能介导APAP急性肝损伤“二次打击”过程中肝细胞程序性坏死。
　　本课题比较不同年龄和性别小鼠对APAP急性肝损伤的敏感性差异，为今后更好地指导不同人群APAP肝损伤的临床治疗提供理论依据；比较野生型（C3H/HeN）与TLR4突变型（C3H/HeJ）小鼠APAP肝损伤的差异，初步探讨TLR4在APAP急性肝损伤不同阶段的作用。
　　方法：
　　研究一、不同年龄和性别小鼠对APAP急性肝损伤的敏感性差异由两个实验组成：实验一、幼年（3周）CD-1小鼠（雌、雄各10只）和成年（8周）CD-1小鼠（雌、雄各10只）分成四组：幼年雄性小鼠、幼年雌性小鼠、成年雄性小鼠和成年雌性小鼠，每组各10只小鼠。所有小鼠统一禁食12小时后经腹腔注射给予单剂量APAP（300mg/kg），观察各组小鼠生存情况至APAP给药后的第7天。绘制各组生存曲线并比较各组小鼠生存率差异。实验二、幼年（3周）CD-1小鼠（雌、雄各40只）和成年（8周）CD-1小鼠（雌、雄各40只）各分成APAP给药组和对照组。所有小鼠统一禁食12小时。所有APAP给药组小鼠经腹腔注射给予APAP（300mg/kg），对照组给予生理盐水。给药后不同时点（第0，1，4和24小时及第7天）剖杀小鼠，比较各组肝指数，检测血清ALT和肝脏GSH、GSSG与GSSG/GSH水平，用HE染色以观察组织肝脏病理学损伤，用TUNEL检测肝细胞死亡，用免疫组化检测肝脏硝化酪氨酸（3-NT）；用实时定量RT-PCR检测肝脏Cyp1a1、Cyp2e1、Cyp3a11、Ugt1a1、Gpx、Gr和Gst基因表达水平；用试剂盒检测肝脏GPX、GR和GST活性；用Western blot检测肝脏CYP2E1、p-JNK、JNK、RIP1和RIP3蛋白水平。
　　研究二、TLR4在APAP急性肝损伤发生过程中的作用由两个实验组成：实验一、野生型（C3H/HeN）小鼠和突变型（C3H/HeJ）小鼠各10只，统一禁食12小时后给予APAP（300mg/kg）单剂量腹腔注射，观察各组小鼠生存情况至APAP给药后72 h。绘制两组小鼠生存曲线并比较两组小鼠生存率的差异。实验二、野生型（C3H/HeN）小鼠和突变型（C3H/HeJ）小鼠各分成APAP给药组和对照组。所有小鼠统一禁食12小时。APAP给药组小鼠经腹腔注射给予APAP（300mg/kg），对照组给予等体积生理盐水。给药后不同时点（第0，4和12 h）剖杀小鼠，比较两组小鼠肝指数，检测血清 ALT水平，用 HE染色以观察肝脏病理学损伤，用TUNEL检测肝细胞死亡，用Western blot检测肝脏p-JNK、JNK以及程序性坏死相关蛋白激酶RIP1、RIP3蛋白的表达。
　　结果：
　　幼年小鼠APAP急性肝损伤较同性别成年小鼠更严重。小鼠生存实验结果提示，雄性或雌性幼年小鼠生存率（雄性50%、雌性60%）均显著低于成年小鼠（雄性80%、雌性90%）。进一步观察发现，与同性别成年小鼠相比，给药后4小时幼年小鼠肝指数和血清ALT水平上升更明显，组织病理学观察到肝脏充血明显；至给药后24小时雄性和雌性幼年小鼠血清ALT水平仍明显高于同性别成年小鼠，组织病理学观察到肝脏呈小叶中心性坏死，且幼年小鼠肝脏坏死面积明显大于同性别成年小鼠；TUNEL检测显示，幼年小鼠肝脏TUNEL阳性细胞数明显高于同性别成年小鼠；免疫印迹实验结果显示，APAP处理后幼年小鼠肝脏p-JNK和RIP3的蛋白水平均明显高于同性别成年小鼠。免疫组化显示，APAP处理后4小时和24小时幼年小鼠肝脏硝化酪氨酸（3-NT）阳性细胞数明显多于同性别成年小鼠。为探讨幼年小鼠对APAP肝损伤更敏感的机制，比较了不同年龄和性别小鼠肝脏APAP代谢酶水平和GSH代谢情况。结果显示，与同性别成年小鼠相比，幼年小鼠在APAP给药后肝脏GSH耗竭量更大，GSSG/GSH比值上升更明显；进一步分析发现，幼年小鼠肝脏Cyp2e1、Cyp3a11的 mRNA水平和CYP2E1蛋白含量均较同性别成年小鼠更高。本课题发现，APAP急性肝损伤性别差异只存在于成年小鼠，成年雄性小鼠APAP急性肝损伤较成年雌性小鼠更严重。APAP处理后4小时和24小时成年雄性小鼠血清ALT水平均高于成年雌性小鼠；组织病理学观察到成年雄性小鼠肝脏坏死面积明显大于成年雌性小鼠；TUNEL检测提示，成年雄性小鼠肝脏 TUNEL阳性细胞数明显高于成年雌性小鼠。进一步观察发现，APAP处理后4小时成年雄性小鼠肝脏p-JNK水平明显高于成年雌性小鼠；免疫组化显示，APAP处理后4小时和24小时成年雄性小鼠肝脏3-NT阳性细胞数明显多于成年雌性小鼠。APAP处理后4小时成年雄性小鼠肝脏GSH消耗量较成年雌性小鼠大，且GSSG/GSH比值恢复速度明显慢于成年雌性小鼠；成年雄性小鼠肝脏GPX和GST活性均低于成年雌性小鼠。
　　野生型（C3H/HeN）小鼠APAP急性肝损伤较突变型（C3H/HeJ）小鼠更严重。72h生存曲线结果提示野生型（C3H/HeN）小鼠给药4小时后即发生死亡，72小时生存率为40%；（C3H/HeJ）小鼠至给药8小时才发生死亡，72小时生存率为70%。故野生型（C3H/HeN）小鼠较突变型（C3H/HeJ）小鼠生存率低。APAP处理4 h后，C3H/HeN小鼠肝指数较C3H/HeJ小鼠上升明显。给药4 h和12 h，C3H/HeN小鼠血清ALT水平均较C3H/HeJ小鼠高。肝脏HE染色提示，C3H/HeN小鼠肝脏坏死面积较大。肝脏TUNEL结果提示，C3H/HeN小鼠肝脏TUNEL+阳性细胞数明显多于C3H/HeJ小鼠。C3H/HeN小鼠在给药后的4 h和12 h，肝脏p-JNK的表达均高于C3H/HeJ小鼠。给药后4 h，C3H/HeN小鼠肝脏RIP1的表达高于C3H/HeJ小鼠；给药后12 h，C3H/HeN小鼠肝脏RIP1的表达与C3H/HeJ小鼠无差异，但肝脏RIP3的表达明显高于C3H/HeJ小鼠。
　　结论：
　　不同年龄小鼠对 APAP急性肝损伤存在敏感性差异，幼年小鼠更易于发生APAP急性肝脏损伤。其机制可能与幼年小鼠肝脏 Cyp2e1、Cyp3a11的 mRNA水平和CYP2E1蛋白含量均较同性别成年小鼠更高；幼年小鼠对于APAP引起的肝脏GSH耗竭更敏感；APAP处理后幼年小鼠肝脏P-JNK和RIP3蛋白表达更高有关。APAP急性肝损伤的性别差异只存在于成年小鼠，具体表现为成年雄性小鼠比成年雌性小鼠肝脏损伤更明显。其机制可能与成年雄性小鼠肝脏GSH代谢酶（GPX和 GST）活性比成年雌性小鼠低，APAP处理后成年雄性小鼠肝脏 GSH消耗多，进而抗氧化以及促进有毒代谢产物的排出能力降低，加剧肝细胞JNK持续性激活，继而导致肝脏损伤加重。在APAP急性肝损伤早期，野生型（C3H/HeN）小鼠APAP肝脏损伤较突变型（C3H/HeJ）小鼠严重，提示TLR4基因突变在APAP急性肝损伤早期中起到保护作用，推测肝脏TLR4信号通路参与激活肝脏JNK、RIP1和RIP3，促进肝细胞程序性坏死。

目录

声明

英文缩略词表

研究背景

参考文献

研究一 不同年龄和性别小鼠对APAP急性肝损伤的敏感性差异

1前言

2材料和方法

3.实验结果

4.讨论

5.结论

参考文献

研究二 TLR4在APAP急性肝损伤发生中的作用

1前言

2 材料和方法

3 实验结果

4讨论

5 结论

参考文献

附录

一、个人基本情况

二、学习经历

三、工作经历

四、在读期间参与或主持的科研课题

五、在读期间发表的论文

致谢

综述:Toll样受体（TLRs）在药物性肝损中的作用