性别差异对小鼠急性化学性肝损伤影响的分子机制

摘要

目的 本课题主要研究CCl4诱导不同性别小鼠的急性化学性肝损伤过程中，肝细胞的应激、增殖、凋亡和代谢等相关因子以及mRNA、microRNAs、lncRNA、circRNA的表达差异，阐明性别差异因素对小鼠急性化学性肝损伤影响的分子机制。 方法 健康昆明小鼠120只，雌、雄各60只，随机分组，三组雌性组(每组20 只) 和 三组雄性组（每组 20 只） ，分组如下：正常组（ normal group, NG），正常加腹腔注射橄榄油组（normal control group , NCG）和腹腔注射CCl4组(0.1%CCl4橄榄油溶液0.1ml/10g) （ carbon tetrachloride group, CTG ）；腹腔注射CCl4 24小时后，将各组小鼠进行眼球采血，离心后取血清，测定各组血清中谷丙（ ALT）、谷草（AST）转氨酶的活性变化。采用颈椎脱臼处死小鼠取肝脏，并将各组均分为三份：一份固定后用于做组织细胞学分析，如下实验：苏木精-伊红（HE）染色检测各组间小鼠肝组织细胞形态损伤的差异情况；过碘酸-雪夫试剂（PAS）染色检测各组间小鼠肝组织细胞糖原的含量变化的差异情况；荧光染料（Hochest33258）荧光染色检测各组小鼠间肝细胞的凋亡差异情况；一份用于mRNA转录测序检测，进行RNA的提取及转录测序，筛选各组肝脏间的差异表达的mRNA、microRNAs、lncRNA、circRNA及其差异基因，并用荧光定量RT-qPCR对测序结果进行验证；一份肝组织混合后研磨提取组织蛋白用于蛋白印迹检测（WB）：检测应激因子HSP27、 HSP70、增殖细胞核抗原PCNA、半胱蛋白酶-3 Caspase-3、Bcl-2 相关 X 蛋白 Bax、Bcl-2 及代谢酶细胞色素P4502E1（CYP2E1）的表达情况。 结果：注射CCl4 24小时后，雌性和雄性小鼠肝损伤情况：1. 血清中AST、ALT酶活性水平，雌性比雄性显著升高 (P<0.01)。2. 苏木精-伊红（HE）染色情况：肝细胞坏死程度，雌性组小鼠显著高于雄性组 (P<0.01) 。3. 过碘酸雪夫试剂（ PAS ）染色结果：雄性组小鼠肝脏细胞中糖原的含量高于雌性组(P<0.05)。4. Hoechst33258 荧光染色情况：结果显示雌性组比雄性组小鼠肝细胞凋亡的数目显著增多 (P<0.01)。5. RNA转录测序结果：雌性小鼠与雄性小鼠mRNA、microRNAs、lncRNA、circRNA均存在显著差异表达，挑选差异表达基因进行荧光定量PCR验证，结果与转录测序结果基本一致。6. 蛋白印迹结果：雄性组比雌性组小鼠肝细胞内HSP27, HSP70, PCNA和Bcl-2 的蛋白表达量高(P<0.05 或 P<0.01) ，而 Bax, Caspase-3, CYP2E1 的蛋白表达量低(P<0.05 或P<0.01)。 结论 小鼠急性化学性肝损伤在糖原储备、RNA表达等方面存在明显的性别差异。这种差异主要通过基因的差异转录 mRNA、miRNA、lncRNA 及circRNA后，翻译产生调节肝细胞应激、增殖、凋亡的相关蛋白的差异表达来完成。

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第1章 绪论

1.1 化学性肝损伤概论

1.1.1 化学性肝损伤的流行病学

1.1.2 致肝损伤的化学物质在体内代谢

1.1.3 化学性肝损伤的发病机制

1.1.4 化学性肝损伤的分类及临床表现

1.1.5 化学性肝损伤的诊断

1.1.6 化学性肝损伤的治疗

1.1.7 化学性肝损伤的预防与预后

1.2 急性化学性肝损伤动物模型的制备

1.3 化学性肝损伤的病理变化

1.4 性别对化学损伤物代谢的影响

1.5 化学性肝损伤机制研究进展

1.5.1 CYP2E1与化学性肝损伤

1.5.2 应激分子与化学性肝损伤

1.5.3 肝细胞的凋亡与化学性肝损伤

1.5.4 化学性肝损伤RNA表达的研究

第2章 前言

第3章 材料与方法

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

3.1.2 实验仪器

3.1.3 实验试剂及配制

3.2 实验方法

3.2.1 实验设计

3.2.2 血清AST、ALT酶活性的检测

3.2.3 肝脏组织的石蜡块制备

3.2.4 组织切片的制作

3.2.5 HE染色检测肝细胞损伤情况

3.2.6 PAS法检测各组肝糖原的含量

3.2.7 Hoechst33258荧光染色法检测肝脏细胞的凋亡情况

3.2.8 WB法检测各组小鼠的HSP27、HSP70、PCNA、Caspase3、Bax、Bcl2及CYP2E

3.2.9 RNA转录测序检测各组小鼠肝脏中mRNA、microRNAs、lncRNA及circRNA的转录情况

3.2.10 荧光定量RT-qPCR验证转录测序结果

3.3实验数据的统计学分析

第4章 结果

4.1 各组血清中AST、ALT的检测结果

4.2 各组小鼠肝脏组织HE染色结果

4.3 各组小鼠肝脏组织PAS染色结果

4.4 各组小鼠肝脏细胞Hoechst33258荧光染色结果

4.5 WB法检测各组小鼠肝组织中HSP27、HSP70、Caspase3、PCNA、Bax、Bcl2、及C

4.6 各组小鼠肝脏组织差异表达mRNA检测结果

4.7 各组小鼠肝脏组织microRNAs转录测序检测结果

4.8 各组小鼠肝组织lncRNA转录测序检测结果

4.9 circRNA的鉴定及差异circRNA的筛选

4.10 RT-qPCR验证实验结果

第5章 讨论

5.1 CCl4诱导小鼠急性化学性肝损伤模型的建立及性别差异对化学性肝损伤的影响

5.2 性别差异对应激分子HSP27、HSP70的影响

5.3 性别差异对肝细胞增殖的影响

5.4 性别差异对肝细胞凋亡的作用

5.5 性别差异对代谢关键酶CYP2E1的作用

5.6 性别差异对肝脏糖原储备的影响

5.7 性别差异对小鼠肝组织mRNA表达谱的影响

5.8 性别差异对小鼠肝组织miRNA表达谱的影响

5.9 性别差异对小鼠肝组织lncRNA表达谱的影响

5.10 问题与展望

第6章 结论

参考文献

附录I图及说明

附录II 表

表1 部分不同性别肝损伤时差异表达的mRNA基因

Table 1 Partial difference gene of liver injury in

注：FC：Fold Change，就是两样品中同一个mRNA表达水平的变化倍数。筛选差异mRNA基因

表2 部分不同性别肝损伤中差异表达的microRNAs

Table 2 Partial difference microRNA of liver injur

注：FC：Fold Change，就是两样品中同一个microRNAs表达水平的变化倍数。筛选差异m

表3 部分不同性别肝损伤中差异表达的lncRNA

Table 3 Partial difference lncRNA of liver injury

注：FC：Fold Change，就是两样品中同一个lncRNA表达水平的变化倍数。筛选差异lncR

表4 部分不同性别肝损伤中差异circRNA

Table 4 Partial difference circRNA of liver injury

注：FC：Fold Change，就是两样品中同一个circRNA表达水平的变化倍数。筛选差异cir

致 谢

攻读学位期间的研究成果