miR-98通过抑制氧化低密度脂蛋白受体-1调控动脉粥样硬化形成的机制研究

摘要

动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）是心血管疾病的最主要病因，其参与多种致命性心血管疾病如：心肌缺血、心绞痛、心肌梗塞以及心力衰竭等。如何抑制延缓 AS的形成，降低 AS性心血管疾病的发生率和死亡率已成为该领域共同努力的目标。AS的形成机制复杂，主要包括以下因素：氧化应激，动脉内皮损伤及功能障碍，泡沫细胞形成以及后续的脂质沉积和血栓形成等。其中氧化应激、内皮功能障碍和泡沫细胞形成均为AS早期的特征性病理变化过程。
　　微小核糖核酸（microRNAs，miRs）是一种由约22个核苷酸组成的RNA小片段，通过与靶基因的信使RNA3’端结合，有效抑制mRNA的转录与翻译，从而发挥不同的生物学效应。研究证实，miRs参与多种心血管疾病，如心肌缺血、心肌纤维化、高血压、糖尿病性心肌病、心力衰竭以及 AS等。然而，这些研究仍处于初期阶段，miRs调控AS的机制如何，如何利用miRs治疗AS都是悬而未决的问题。
　　前期研究结果发现，AS患者血浆中的某些miRs较健康志愿者表达存在明显差异。通过生物信息学预测并分析microarray数据，发现这些miRs具有一个共同的靶基因，氧化低密度脂蛋白受体-1（lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1）。LOX-1是氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein, Ox-LDL）在细胞膜上的受体，具有清道夫受体的特性。如前所述，AS早期主要表现为氧化应激、内皮功能障碍、泡沫细胞形成以及脂质沉积。因此，本研究针对上述特点，采用科学的筛选方法选取一个最具代表性的miR，研究其对AS的影响，并进一步探讨其可能的机制。研究内容主要包括以下四个部分：
　　1. AS患者与健康志愿者血浆miRNA表达比较
　　首先采用microarray技术检测AS患者与健康志愿者血浆miRs及mRNAs的表达。发现28个miRs以及32个mRNA表达发生明显变化。通过Real-time PCR验证结果发现 miR-98表达变化具有统计学意义。利用生物信息学软件再次验证miR-98与LOX-1存在结合位点。LOX-1是AS形成中的重要调节因子，提示miRs可能通过调控LOX-1表达影响AS的形成。
　　2.体外模拟AS环境评估miR-98对AS形成的影响
　　为模拟AS的体外环境，本研究使用Ox-LDL干预人主动脉内皮细胞，结果发现随着Ox-LDL浓度的逐步升高（0-10μg/mL），miR-98的表达逐渐降低，而与此同时，LOX-1的表达逐渐增高。提示LOX-1与miR-98可能存在密切联系。将miR-98 mimic和inhibitor转染入细胞，发现LOX-1表达被明显抑制或增强。由于诸多因素参与 AS的形成，本研究同时检测了氧化应激反应（活性氧自由基[reactive oxygen species, ROS]），内皮功能相关因子表达（内皮素-1[endothelin-1, ET-1]、内皮型一氧化氮合酶[endothelial nitric oxide synthase, eNOS]、诱导型一氧化氮合酶[inducible nitric oxide synthase, iNOS]），内皮细胞通透性，泡沫细胞形成（巨噬细胞油红O染色）。结果发现，与对照组相比，miR-98 mimic转染的内皮细胞组ROS、ET-1、iNOS表达降低，eNOS表达增高，泡沫细胞形成减少。miR-98 inhibitor作用与之相反。提示miR-98可能参与调控AS的形成。
　　3. miR-98对小鼠AS的影响
　　为模拟AS的体内环境，本研究采用LDLr-/-小鼠模型，并对其注射agomiR-98或antagomiR-98，检测小鼠主动脉LOX-1、ET-1、eNOS、iNOS表达情况，以及其对内皮通透性以及脂质沉积的影响。结果发现，agomiR-98可明显抑制LOX-1、ET-1、iNOS的表达，增加eNOS表达，减少动脉内膜的脂质沉积，并降低内皮通透性改善内皮功能。而antagomiR-98的作用与之相反。进一步提示miR-98可能参与调控AS的形成。
　　4.验证LOX-1是miR-98的靶基因
　　为明确LOX-1是否为miR-98的靶基因，本研究采用荧光素酶报告基因进行检测，结果发现 miR-98 mimic组的荧光强度较对照组明显降低，而相同浓度的miR-98 inhibitor则明显增高；当点突变LOX-13’-UTR后（沉默miR-98与LOX-1的结合位点），其已被miR-98 mimic抑制的荧光强度又恢复正常。提示LOX-1是miR-98的靶基因，其结合位点是LOX-13’-UTR上的447-453片段。由此验证了假设并得出结论：miR-98通过抑制LOX-1表达抑制AS的形成。
　　5.小结
　　miR-98通过抑制其靶基因LOX-1参与调控AS早期的特征性病理变化过程，抑制活性氧自由基生成，抑制ET-1、iNOS，增加eNOS的表达，从而改善动脉内皮功能，以及抑制泡沫细胞形成和动脉内膜脂质沉积。本研究为应用微小 RNA预防和治疗AS提供了理论和实验依据。

目录

声明

中英文缩写词对照

1 引言

2实验材料

2.1 患者血浆

2.2 实验动物

2.3 实验细胞

2.4 药品与试剂

2.5 引物基因序列

2.6仪器与设备

2.7 图像分析软件

3实验方法

3.1临床实验部分

3.2细胞实验部分

3.3动物实验部分

3.4 统计学分析

4 结果

4.1 健康志愿者及AS患者各项指标对比

4.2 健康志愿者及AS患者血浆miRNA表达谱对比

4.3 健康志愿者及AS患者血浆mRNA表达谱对比

4.4 miRNA及靶基因的筛选

4.5 microarray表达谱数据验证

4.6除LOX-1以外的靶基因

4.7 生物信息学预测验证LOX-1

4.8 健康志愿者及AS患者血浆miR-98及LOX-1表达

4.9 miR-98仅在内皮细胞和巨噬细胞中表达

4.10 Ox-LDL对内皮细胞和巨噬细胞的毒性检测

4.11内皮细胞和巨噬细胞摄取Ox-LDL能力检测

4.12 Ox-LDL对人主动脉内皮细胞miR-98、LOX-1表达的影响

4.13 miR-98 mimic和inhibitor转染浓度筛选

4.14 miR-98 mimic和inhibitor对LOX-1表达的影响

4.15 miR-98 mimic和inhibitor对ROS的影响

4.16 Ox-LDL对NF-κB p65及内皮细胞功能的影响

4.17 miR-98 mimic和inhibitor对NF-κB p65及内皮细胞功能的影响

4.18 miR-98 mimic和inhibitor对巨噬细胞LOX-1表达和泡沫细胞形成的影响

4.19 LOX-1 siRNA阻断miR-98 inhibitor对上述因子的作用

4.20 LOX-1是miR-98的靶基因

4.21其他潜在靶基因对AS的作用

4.22 AgomiR-98和AntagomiR-98注射小鼠脂代谢参数

4.23 AgomiR-98和AntagomiR-98体内干预成功率及副作用检测

4.24 AgomiR-98和AntagomiR-98对LDLr-/-小鼠胸主动脉LOX-1表达的影响

4.25 AgomiR-98和AntagomiR-98对LDLr-/-小鼠胸主动脉组织NF-κB p65及内皮细胞功能的影响

4.26 AgomiR-98和AntagomiR-98对LDLr-/-小鼠胸主动脉脂质沉积的影响

4.27 AgomiR-98和AntagomiR-98对LDLr-/-小鼠其他潜在靶基因的作用

5 讨论

5.1 miRNA与AS

5.2 miRNA与LOX-1

5.3 miR-98与氧化应激

5.4 miR-98与内皮功能

5.5 miR-98与泡沫细胞形成及脂质沉积

5.6 miR-98的靶基因

5.7 实验的局限性

5.8小结

6 结论

参考文献

附录

致谢

综述:Scavenger Receptors and Non-coding RNAs:Relevance in Atherogenesis