乳酸杆菌表面活性片段通过表观遗传学调控肠上皮炎性细胞因子表达的机制研究

摘要

目的：
　　观察MIMP对炎症性肠病小鼠的肠道炎症及肠道微生态的影响；探究MIMP对炎性细胞因子的作用效果和调节方式，并探讨相关作用机制。
　　方法：
　　（1）将小鼠分为3组：DSS+MIMP组，DSS组和健康对照组。干预期间，观察小鼠体重变化情况，腹泻、血便、死亡等发生率，观察各组小鼠肠道整体情况并制作H&E染色切片，观察肠上皮组织病理学的改变；利用右旋糖苷异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate-dextran,FITC-Dextran）灌胃，检测小鼠活体肠道通透性，并利用蛋白质印迹（Western blot）和实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)检测各组小鼠肠道上皮中紧密连接蛋白（JAM-1,Occludin,ZO-1）的表达水平；利用qRT-PCR检测各组小鼠肠道上皮中炎性细胞因子(IFN-γ,IL-17,IL-23,IL-4,IL-10）的表达,利用16SrRNA测序技术检测各组小鼠肠道微生态的变化情况。
　　（2）利用类小肠上皮细胞的Caco-2细胞和外周血单核细胞（PBMCs）在Tranwells条件下建立共培养模型，利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作为炎症刺激，利用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测MIMP在不同浓度及不同孵育时间下对肠道微环境中炎性细胞因子(IFN-γ,IL-17,IL-23,IL-4,IL-10）的调节情况。利用ELISA和qRT-PCR检测TLR4抑制剂对LPS介导的炎性细胞因子分泌水平的影响，并与MIMP的作用效果相互比较。利用Western blot检测MIMP和TLR4抑制剂对MAPK及NF-κB通路的调节情况，并利用双荧光素酶报告基因实验检测MIMP在不同浓度及不同孵育时间下对NF-κB活性影响的变化趋势。
　　（3）利用Western blot检测MIMP及TLR4抑制剂对由LPS介导的Caco-2细胞整体水平的组蛋白（H3,H4）乙酰化的调节情况，利用染色质免疫共沉淀技术(ChIP)技术检测MIMP在不同浓度及不同孵育时间下对具体水平的IL-17及IFN-γ上游启动子区域组蛋白（H3,H4）乙酰化的调节情况；利用qRT-PCR检测MIMP对LPS介导的组蛋白去乙酰化酶(histone deaceylase,HDAC)表达水平的调节情况。
　　结果：
　　（1）与DSS组小鼠相比，MIMP+DSS组整体情况较好，体重减轻程度轻，腹泻、便血及死亡发生率低，疾病活动指数显著下降；MIMP不但可以改善肠道整体情况，提高肠道长度(p<0.05)，还可有效提升组织学评分(p<0.001)；MIMP+DSS组血浆中 FITC-Dextran的含量显著低于 DSS组(p<0.01)，而肠上皮中紧密连接蛋白（JAM-1,Occludin,ZO-1）的表达水平则显著高于 DSS组(p<0.01)。此外，MIMP可降低肠道上皮中促炎性细胞因子（IFN-γ,IL-17,IL-23）的水平，并升高抑炎性细胞因子（IL-4,IL-10）的水平。16SrRNA测序发现MIMP+DSS组较DSS肠道微生态多样性显著提升，shannon指数显著降低(p<0.05),simpson指数存在一定上升趋势(p=0.055)；主坐标分析(principal coordinate analysis, PCoA)提示三组小鼠肠道微生态在各分类学水平上存在明显差异；样本聚类树与柱状图组合分析(The sample clustering tree and histogram analysis)提示MIMP+DSS组与健康对照组肠道微生态的相似程度更高；线性判别分析(LEfSe)分析显示厚壁菌属(Firmicute)是 DSS组小鼠肠道中的优势菌属，明串珠菌属(Leuconostocaceae)是DSS+MIMP组的优势菌属，拟杆菌属(Bacteroides)是健康对照组肠道中的优势菌属。
　　（2）在共培养模型中，MIMP可扭转因LPS引起的炎性细胞因子的分泌，降低促炎性细胞因子（IFN-γ,IL-17,IL-23）的水平，升高抑炎性细胞因子（IL-4,IL-10）的水平；且 MIMP的调节存在一定的剂量与时间依赖性，在特定浓度和时间时(1ng/ml,12h)，MIMP的作用效应最为显著；同时抑制性实验证实MIMP与TLR4抑制剂具有相同的调节炎性细胞因子的能力；此外，MIMP和TLR4抑制剂均可有效
　　阻断MAPK及NF-κB通路激活，且随着MIMP剂量的提高和时间的延长，NF-κB的活性也呈现阶梯状下降趋势。
　　（3）LPS可使得组蛋白（H3,H4）整体水平的乙酰化程度提高，而 MIMP与 TLR4抑制剂干预可有效降低其乙酰化程度，并存在剂量依赖性；在具体水平中，随着剂量的提高和时间的延长，MIMP可有效降低IL-17和IFN-γ上游启动子区域组蛋白（H3,H4）的乙酰化程度；同时，MIMP还可以显著上调部分HDAC的表达。
　　结论：
　　MIMP可有效改善IBD小鼠的炎症状态及肠屏障功能，显著下调促炎性细胞因子的表达，上调抑炎性细胞因子的表达，并纠正IBD小鼠的肠道微生态紊乱；MIMP可通过一定剂量和时间依赖的方式调节炎性细胞因子的分泌，并可有效阻断 MAPK及NF-κB信号通路的激活；MIMP可有效降低整体及具体水平的组蛋白乙酰化程度，提高HDAC的表达。本研究发现了MIMP改善肠道炎症的现象并阐明其相关机制，扩展了人们对于炎症治疗的认识，具有一定的理论创新。

目录

声明

符号说明

1 引言

2 实验内容

2.1 乳酸杆菌表面活性片段改善炎症性肠病小鼠疾病程度及调节肠道微生态的功能研究

2.1.1 概述

2.1.2 材料与方法

2.1.3实验结果

2.1.4 讨论

2.2乳酸杆菌表面活性片段调控肠上皮炎性细胞因子表达的机制研究

2.2.1 概述

2.2.2 材料与方法

2.2.3 结果

2.2.4 讨论

3 结论

参考文献

附录

致谢

综述:抗菌肽在胃肠道疾病中的研究进展