乳酸杆菌表面蛋白活性片段MIMP诱导肠上皮细胞MAPK信号通路调控occludin表达的机制研究

摘要

目的和意义:
　　 益生菌及其表面蛋白对肠上皮细胞具有重要的保护作用，而乳酸菌表面蛋白是黏附到肠上皮细胞的结构域片段。本研究旨在鉴定乳酸杆菌表面黏附蛋白及其微小活性片段(MIMP)，并通过正常人结肠上皮细胞(NCM460)，树突状细胞(DC)，和白介素10基因敲除(IL-10-/-)小鼠对其进行功能学验证，建立NCM460/MIMP瞬时转染细胞，进一步探索MIMP对肠屏障功能障碍保护作用的分子机制。通过本课题的研究，可望获得若干新的发现，有利于从分子水平寻求乳酸杆菌活性成分对肠屏障功能障碍防治新的思路和方法。
　　 方法:
　　 1通过生物信息学和分子生物学技术，对植物乳酸杆菌CGMCC1258表面蛋白进行鉴定并纯化；通过构建乳酸杆菌整合膜蛋白中间片段的突变蛋白，结合Westernblot法鉴定乳酸杆菌表面蛋白的微小活性片段MIMP；并通过免疫家兔制备MIMP的多克隆抗体。
　　 2通过竞争黏附实验验证MIMP对侵袭性大肠杆菌(EIEC)和致病性大肠杆菌(EPEC)的竞争抑制作用；检测NCM460细胞跨膜电阻值和对大分子的通透性评价MIMP对肠上皮细胞通透性的影响；免疫荧光法，Western blot法，实时定量PCR法，及电镜检测MIMP对紧密连接蛋白，Claudin-1，occludin，JAM-1和ZO-1的表达水平和超微结构的影响；流式细胞术，Western blot法，免疫荧光法及酶联免疫吸附实验检测MIMP对DC的促成熟作用，和对细胞因子的分泌及Th1/Th2细胞分化的影响z此外，MIMP对白介素10基因敲除小鼠肠道通透性，紧密连接蛋白的表达水平和超微结构，及肠道炎症水平的影响也进行了检测。
　　 3通过将MIMP基因连接入pcDNA3.1(-)载体并转导入NCM460细胞构建NCM460/MIMP瞬时转染细胞。通过流式细胞术检测NCM460/MIMP细胞MIMP的表达水平；通过竞争黏附实验检测EPEC对NCM460/MIMP细胞的黏附率；利用Western blot法，免疫荧光法和实时定量PCR法检测NCM460/MIMP细胞紧密连接蛋白的表达水平；电镜观察NCM460/MIMP细胞的超微结构；Western blot法检测PKC-η和磷酸化occludin的表达水平。
　　 4免疫共沉淀加质谱鉴定检测MIMP对应的NCM460细胞膜受体。Western blot法检测MIMP及其受体对occludin，p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK的影响；免疫荧光法检测p38 MAPK信号通路对occludin表达的影响。
　　 5所有数据采用均数±标准差(X±SD)表示，采用GraphPad PRISM5.0和SPSS11.0 for windows版统计软件进行统计分析，每组实验重复三次，对各组数据进行单因素方差分析，组间采用Bonferroni(LSDMOD)-Dunnett T3 t检验进行比较。P<0.05认为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1首次鉴定和纯化了植物乳酸杆菌CGMCC1258的表面黏附蛋白IMP以及其活性片段MIMP(IMP515-575)。
　　 2.MIMP能降低EIEC和EPEC对NCM460细胞的黏附率，缓解NCM460细胞电阻值的下降，抑制其对甘露醇通透性的增加，提高紧密连接蛋白的表达水平并维持其正常结构；MIMP能通过DC表面非整合素的粘附受体(DC-SIGN)促进其分化成熟，增加白介素10和白介素6的分泌，并促进Th2细胞的分化；此外，MIMP能降低白介素10基因敲除小鼠肠上皮通透性，减少肿瘤坏死因子α，γ干扰素及髓过氧化物酶的分泌，提高紧密连接蛋白的表达及保护其正常结构。
　　 3建立了NCM460/MIMP细胞，其MIMP的表达水平为82.16％±12.22％，与对照组NCM460细胞相比显著升高。EPEC对NCM460/MIMP细胞黏附率显著下降；EPEC感染后NCM460/MIMP细胞紧密连接蛋白的表达水平及荧光强度与对照组相比明显增加；其PKC-η和磷酸化occludin的表达水平也较对照组显著升高。
　　 4鉴定了甘露糖受体为MIMP在NCM460细胞对应的受体。甘露糖受体的抗体能抑制MIMP对NCM460细胞的保护作用；MIMP与其受体相互作用后，能显著降低磷酸化p38 MAPK的表达水平；加用p38 MAPK激动剂能降低NCM460细胞occludin的表达水平。
　　 结论：
　　 1首次鉴定了植物乳酸杆菌CGMCC1258的表面黏附蛋白IMP及其活性成分MIMP。
　　 2 MIMP能降低IEC的通透性，保护肠屏障功能；通过与DC-SIGN与DC相互作用促进DC的分化成熟，调整炎症因子的分泌，诱导Th2细胞的分化；减轻小鼠肠道炎症因子的分泌，减轻小鼠肠道炎症反应。
　　 3建立了NCM460/MIMP瞬时转染抗感染细胞，验证了其抗感染作用与PKC-η诱导的occludin磷酸化有关。
　　 4 MIMP对IEC的保护作用主要通过甘露糖受体抑制p38 MAPK的磷酸化起作用。