弓形虫效应分子GRA15Ⅱ诱导巨噬细胞极化抗小鼠肝癌的研究

摘要

背景：
　　肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，死亡率位于第二位。近年来肿瘤的免疫治疗（immunotherapy），即通过打破机体或肿瘤局部的免疫耐受或免疫抑制，来提高机体自身的免疫功能，已成为―带瘤生存‖新理念和治疗的重要手段之一。肿瘤免疫疗法能够激活机体免疫系统，重建正常的免疫预警功能，具有靶向性强、毒副作用低、可产生免疫记忆等优点。在肿瘤的炎症微环境中，浸润于肿瘤间质中的巨噬细胞(tumor- associated macrophages，TAMs)与肿瘤的发生、发展关系密切。已有研究显示，经典途径激活巨噬细胞（M1型）具有较高的抗原递呈能力，发挥正向免疫调节和细胞毒作用，而替代活化途径获得的巨噬细胞（M2型）具有较弱的抗原递呈能力，参与负向免疫调节。
　　刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种机会致病性的专性有核细胞内寄生原虫。广泛分布在北美和欧洲的弓形虫主要包括Ⅰ型虫株（如RH株、GT1株等），Ⅱ型虫株（如 PRU株、ME49株等）以及Ⅲ型虫株（如 CTG株等）。机体在抗弓形虫感染过程中，作为第一道屏障，Mφ与弓形虫感染、增殖和播散密切相关。已有研究发现不同基因型的虫株诱导机体内 Mφ向不同的方向偏移（bias），甚至极化（polarization），其中多态效应分子 GRA15在感染早期即可直接激活宿主细胞的 NF-κB，驱动 Mφ向 M1极化，在宿主固有免疫中发挥重要作用，同时也诱导Th1型免疫应答。
　　目的：
　　探讨弓形虫效应分子GRA15II诱导经典途径活化的巨噬细胞（M1）逆转小鼠肝癌微环境中的TAMs从M2向M1极化，抑制肿瘤增殖、侵袭及转移，旨在为肿瘤免疫治疗提供新思路和新策略。
　　方法：
　　从Ⅱ型弓形虫 PRU株中提取总 RNA，扩增多态性 GRA15II编码基因，构建重组质粒 pEGFP-gra15II。体外将质粒亚克隆入慢病毒载体并感染小鼠细胞系RAW264.7，使之诱导为 M1。体外分别将 Lv-gra15Ⅱ-Mφ（A组），空白病毒载体Lv-Mφ（B组）和未感染Mφ（C组）与小鼠肝癌细胞系Hepa1-6进行transwell共培养，观察上述三组Hepa1-6的增殖、迁移和侵袭能力，以及MMP-9和MMP-2表达。体内实验，取75只SPF级4-5w龄雌性C57/BL6小鼠，右腹股沟皮下接种Hepa1-6成瘤。3d后随机分为3组，每组25只。A组为在小鼠皮下接种成瘤后3d和5d，分别经尾静脉给予重悬于150μl生理盐水的2×106 Lv-gra15Ⅱ-Mφ；B组给予重悬于150μl生理盐水的2×106 Lv-Mφ；C组给予150μl生理盐水。在皮下注射成瘤10d后无痛处死小鼠。追踪荷瘤鼠体内输入的巨噬细胞；观察输入的巨噬细胞对脾脏的影响；剥离肿瘤组织，观察实体瘤体积；免疫组化检测肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）浸润和免疫抑制因子及血管生成相关因子的表达；瘤体 qRT-PCR检测iNOS、TGF-β、VEGF、IL-6和IL-10表达；ELISA检测 IL-6水平的变化。
　　结果：
　　GRA15II体外可驱动 RAW264.7向 M1方向极化。 FCM、细胞培养上清和qRT-PCR检测结果均显示，相比于 Lv-Mφ和 Mφ，Lv-gra15Ⅱ-Mφ的 PD-L1、CD80、NO、TNF-α、IL-12p40和 iNOS表达有显著升高（P<0.05）。体内试验TAMs检测结果，Lv-gra15Ⅱ-Mφ可减轻 TAMs浸润，并且使其向 M1方向偏移，抑制肿瘤的增生。冰冻切片的结果显示，输入的巨噬细胞循环至实体瘤内，且至少存活72h。实体瘤免疫组化分析显示，A组 TAMs浸润显著减少（P<0.05），IL-10和 TGF-β及血管内皮生长因子（VEGF）表达下调，而MHC II表达增加。qRT-PCR检测显示 A组小鼠实体瘤中 iNOS表达明显增加（P<0.05），而 TGF-β、VEGF、IL-6和 IL-10表达下调。ELISA检测显示 A组瘤体内的 IL-6分泌显著下调（P<0.05）。脾脏冰冻切片检查见到，输入的活化巨噬细胞通过调节全身的免疫力来对抗肿瘤生长。脾脏的 TNF-α(P<0.01)，IL-12（P<0.05）在 mRNA转录水平升高，相反 IL-6（P<0.01）和 IL-10（P<0.01）在 mRNA转录水平降低。体外共培养实验显示，Lv-gra15Ⅱ-Mφ可抑制小鼠肝癌细胞 Hepa1-6迁移、侵袭，可下调其外基质相关蛋白的分泌，而对 Hepa1-6凋亡无影响。qRT-PCR和蛋白水平检测均显示A组与B组和C组比较，MMP-9和MMP-2表达显著下调（P<0.05）。
　　结论：
　　以上研究结果表明，弓形虫效应分子 ToxoGRA15II可以诱导巨噬细胞向经典途径方向极化，进一步通过调节肿瘤和脾脏中相关细胞因子的表达来限制肿瘤的发展。此外，由于 ToxoGRA15II针对特定细胞群的激活并且对哺乳动物无毒，在增强宿主抗肿瘤先天性免疫和肿瘤的免疫治疗方面具有潜在价值，值得深入研究。

目录

声明

1 前言

2 材料与方法

2.1材料

2.2实验方法

3 结果

3.1获得RAW264.7稳定转染细胞

3.2 GRA15II可驱动RAW264.7向M1极化

3.3 LV-gra15II-Mφ减轻肿瘤细胞Hepa1-6在体内的增殖

3.4 LV-gra15II-Mφ治疗荷瘤小鼠脾细胞分泌细胞因子的变化

3.5 LV-gra15II-Mφ可降低Hepa1-6在体外的侵袭和迁移能力

3.6 LV-gra15II-Mφ不会引起C57BL/6小鼠明显的同种异体反应

4 讨论

5 结论

6 参考文献

7 附录

7.1个 人 简 历

7.2攻读硕士期间所获荣誉

7.3 在读期间发表论文情况：

7.4 硕士研究生期间参与科研项目：

致谢

9 综述:适应性免疫应答在宿主抗弓形虫感染中的研究进展