同型半胱氨酸调控MLCK影响实验性结肠炎肠粘膜通透性的作用研究

摘要

背景：炎症性肠病（Inflammatory bowel disease, IBD）是一种目前发病机制尚不十分明确的慢性肠道炎症性疾病。既往研究表明，肠道粘膜紧密连接结构的破坏引起肠粘膜通透性增加对 IBD的发病过程具有重要影响。同型半胱氨酸（homocysteine, Hcy）是一种含硫氨基酸，是甲硫氨酸代谢的重要中间产物。研究发现Hcy可能通过多种途径影响内皮细胞屏障功能，提高内皮细胞通透性，促进炎症反应。炎症性肠病（IBD）患者血浆和结肠粘膜组织中Hcy水平增高，但Hcy是否通过影响肠上皮细胞紧密连接结构及功能，进一步影响肠粘膜通透性参与IBD的病理生理过程尚不明确。因此，本研究拟在建立大鼠TNBS/乙醇结肠炎模型及人结肠癌Caco-2细胞株的基础上，探讨同型半胱氨酸对实验性结肠炎肠粘膜通透性及Caco-2细胞单层通透性的影响及其作用机理。
　　目的：探讨同型半胱氨酸（Hcy）对实验性结肠炎大鼠小肠粘膜通透性及Caco-2细胞单层通透性的影响及作用机理。
　　方法：1. Caco-2细胞经Hcy预处理不同信号通路抑制剂（ERK抑制剂 PD98059, P38MAPK抑制剂 SB203580, Rho抑制剂 Y27632, Ca2+/Calmodulin抑制剂 KN62, PKC抑制剂 Staurosporine以及 MLCK抑制剂 ML-7）之后，加入 FITC。记录Caco-2细胞TEER随时间变化情况，同时于 lower chamber取样，样品中 FITC浓度通过荧光分光光度计测定。实验结束后收集细胞悬液，Western blot方法检测细胞中 MEK，ERK，p-ERK, MLCK, p-MLCK, ZO-1, Claudin-1, Claudin-2, Occludin蛋白表达。2.使用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇灌肠制备实验性大鼠结肠炎模型，采用皮下注射同型半胱氨酸造成高同型半胱氨酸血症（HHcy）模型。3. SD雄性大鼠，分成4组：A组为对照组（NS注射+NS灌肠），B组为对照+Hcy注射组（Hcy注射+NS灌肠），C组为TNBS模型组（NS注射+TNBS/乙醇灌肠），D组为TNBS模型+Hcy注射组（Hcy皮注射+TNBS/乙醇灌肠）。4.记录观察大鼠每日体重变化及粪便情况，根据大鼠症状及体重变化情况进行疾病活动性评分（DAI），切取实验性结肠炎大鼠结肠标本行HE染色，并行结肠组织学损伤评分（HI）5.大鼠结肠Hcy及MLCK水平通过ELISA方法检测，大鼠结肠MPO活性通过四甲基联苯胺法测定，大鼠小肠粘膜组织中 MEK，ERK，p-ERK, MLCK, p-MLCK, ZO-1, Claudin-1, Claudin-2, Occludin蛋白表达使用免疫组化及western blot方法测定，MLCK mRNA表达通过RT-qPCR方法检测。
　　结果：与对照组相比，Caco-2细胞使用50μmol/L Hcy预处理时TEER降低明显。与Hcy组相比，Caco-2细胞经ML-7及PD98059药物预处理后TEER下降减缓，FITC跨膜转运量有所降低，MLCK，p-MLCK，Claudin-2蛋白表达有所降低，ZO-1，Claudin-1，Occludin蛋白表达有所回升，表明 MEK-ERK-MLCK信号通路在 Hcy影响Caco-2细胞通透性的过程中具有影响。与正常对照组及TNBS模型对照组相比，TNBS模型+Hcy皮下注射组DAI，HI，MPO显著升高，结肠 MLCK水平明显增加，大鼠小肠组织中MEK，ERK，p-ERK, MLCK, p-MLCK, Claudin-2蛋白表达升高，ZO-1, Claudin-1, Occludin蛋白降低（P<0.05），表明Hcy可能通过调控MEK-ERK-MLCK通路影响实验性结肠炎大鼠小肠粘膜细胞紧密连接蛋白表达，增加肠粘膜通透性。
　　结论：Hcy可影响 Caco-2细胞及实验性结肠炎大鼠小肠粘膜通透性，机制可能与调控MLCK表达影响肠道粘膜上皮细胞紧密连接通透性有关。

目录

声明

英文缩略词

1 前言

2.材料与方法

2.1材料

2.1.1实验动物

2.1.2药品和试剂

2.1.3 实验仪器

2.2 方法

2.2.1 Caco-2细胞通透性模型的建立及分组

2.2.2 具备高同型半胱氨酸血症的实验性结肠炎模型的建立及分组

2.2.3 标本采集

2.2.4 检测方法

2.2.5 数据统计分析

3.实验结果

3.1 不同浓度Hcy对Caco-2细胞通透性的影响

3.2 Hcy影响Caco-2细胞通透性机制的初步探讨

3.3 Hcy对实验性结肠炎大鼠结肠炎症损伤的影响

3.4 Hcy对结肠炎大鼠小肠粘膜上皮细胞通透性的影响

3.5 Hcy对结肠炎大鼠小肠粘膜中MLCK水平的影响。

3.6 Hcy对结肠炎大鼠小肠粘膜中上皮细胞MEK，ERK，p-ERK，MLCK，p-MLCK， Claudin-1，Claudin-2，Occludin及ZO-1蛋白表达及MLCK mRNA的影响

4.讨论

5.结论

6.存在的不足

参考文献

附录个 人 简 历

致谢

综述:同型半胱氨酸与内皮细胞屏障的关系及研究进展