帕罗西汀对胶原性关节炎大鼠T细胞活化及在关节滑膜中浸润的影响

摘要

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种常见自身免疫病，其基本病理变化为组织的变质、渗出和增生，典型的急性炎症表现为红、肿、热痛和功能障碍。参与炎症应答的细胞都可称作炎症细胞，其中淋巴细胞和巨噬细胞是免疫炎症的中心细胞。早期诊断和治疗是防治关节损伤的关键。使用缓解病情抗风湿药是目前RA治疗的基本策略，但这些药物都有明显的不良效应，且治疗的有效率不高，因此深入研究RA发病机理、寻找新的治疗靶点以及开发新型有效药物是RA研究的主要方向。RA发病初期，多种免疫细胞包括T、B细胞和巨噬细胞等在趋化因子等作用下迁移至滑膜组织，是RA关节炎的启动因素。趋化因子受体为 G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor, GPCR），其功能受G蛋白偶联受体激酶（G protein coupled receptor kinases, GRKs）的精确调控。调节GRKs功能是否可以减少免疫细胞向滑膜组织迁移尚不清楚。帕罗西汀（paroxetine）为选择性GRK2抑制剂，其是否通过抑制 GRK2影响免疫细胞活化及在滑膜组织中浸润从而抑制关节炎症也未见报道。
　　目的：探讨GRK2在胶原性关节炎（collagen induced arthritis, CIA）大鼠免疫细胞活化和在滑膜组织中浸润的作用及帕罗西汀的作用机制。
　　方法：以Wistar大鼠建立CIA模型；造模d14左右开始出现关节炎症，根据关节炎指数将模型组大鼠随机分为溶媒对照组（CIA-Veh），帕罗西汀（15mg/kg/d）（CIA-Par）和 MTX（0.5mg/kg/3d）（CIA-MTX）灌胃给药组，给药15天，每3天进行整体指标评价。给药结束处死大鼠进行踝关节病理检查及评分；计算胸腺和脾脏指数；CCK法检测脾脏T细胞活力；ELISA法检测血清和滑膜匀浆中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor, TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）和趋化因子（C-X3-C-基元）配体1（chemokine(C-X3-C motif) ligand1, CX3CL1）水平；流式细胞术分析滑膜组织中T、B、巨噬细胞含量和外周血T细胞亚群比例变化；免疫组化法观察滑膜组织T细胞浸润情况；Transwell法检测T细胞迁移能力；Lipofectamine3000系统转染pIRES-EGFP-GRK2和pIRES-EGFP质粒至脾脏T细胞，Western blot和免疫荧光检测转染T细胞中GRK2表达水平；Western blot法检测各给药组脾脏T细胞GRK2表达和MAPK通路分子磷酸化。
　　结果：
　　1.帕罗西汀对大鼠CIA整体指标的影响
　　在大鼠CIA发病早期（第一次致炎后14天左右）给予帕罗西汀或MTX治疗，各治疗组大鼠的全身表现评分、足爪肿胀度、关节炎指数和关节肿胀数较 CIA模型组大鼠显著下降，给药组大鼠体重明显恢复。
　　2.帕罗西汀对CIA大鼠踝关节病理改变的影响
　　踝关节病理检查发现，CIA大鼠的关节滑膜细胞增生明显，并有较多的免疫细胞浸润，同时还能观察到明显的血管翳形成和血管扩张；帕罗西汀和MTX治疗组大鼠的关节病理得到明显改善。
　　3.帕罗西汀对CIA大鼠胸腺和脾脏指数的影响
　　CIA大鼠的胸腺和脾脏较正常组大鼠明显肿大，指数明显升高；帕罗西汀和MTX给药可显著降低CIA大鼠胸腺和脾脏指数。
　　4.帕罗西汀对CIA大鼠血清和滑膜组织细胞因子和趋化因子水平的影响
　　CIA大鼠血清和滑膜匀浆中TNF-α、IL-1β和CX3CL1表达水平明显升高，帕罗西汀和MTX给药可显著降低CIA大鼠血清和滑膜中上述因子水平。
　　5.帕罗西汀对免疫细胞在滑膜组织中浸润的影响
　　在CIA大鼠膝关节滑膜组织单细胞消化液中可检测到大量CD4+辅助性T细胞（helper T, Th）、CD8+杀伤性T细胞（cytotoxic T cell, Tc）、CD45R+B细胞、CD11b+巨噬细胞；帕罗西汀和MTX治疗可显著减少Th和Tc细胞浸润。MTX可抑制B细胞和巨噬细胞的滑膜组织浸润，帕罗西汀对 B细胞和巨噬细胞迁移没有明显影响。免疫组化结果显示，CIA大鼠关节滑膜中有较多的 T细胞浸润，帕罗西汀和MTX治疗可不同程度减少滑膜组织中的T细胞数量。
　　6.帕罗西汀对T细胞活力和活化的影响
　　CIA大鼠外周血CD3+CD4+辅助性T细胞（helper T, Th）、CD4+CD25+Foxp3-活化Th细胞（activated Th, Thact）、CD4+CD44+效应Th细胞（effector Th, Theff）、CD8+CD44+效应 Tc细胞（effctor cytotoxic T，Tceff）较正常大鼠明显增多，而CD4+CD62L+幼稚 Th细胞（na?ve Th, Thnaive）、CD4+CD25+Foxp3+调节性 T细胞（regulatory T, Treg）、CD8+CD62L+幼稚杀伤性T细胞（na?ve cytotoxic T，Tcnaive）比例减少；Th/Tc、Theff/Thnaive、Tceff/Tcnaive比率升高，帕罗西汀和MTX的治疗可显著恢复T细胞亚群的平衡。CCK法检测发现，CIA大鼠脾脏T细胞活力明显增强，帕罗西汀和MTX可有效降低T细胞活力。
　　7.GRK2在T细胞迁移中的作用及帕罗西汀的影响
　　Western blot检测发现，脾脏T细胞GRK2表达在造模后d14明显升高，d28达高峰，缓解期有下降趋势；帕罗西汀体内给药显著减少脾脏T细胞GRK2表达。体外使用CX3CL1刺激纯化得到的脾脏T细胞，诱导其迁移，同时给予不同浓度帕罗西汀和MTX，检测发现帕罗西汀和 MTX体外给药显著抑制 T细胞迁移。T细胞中高表达GRK2可以促进迁移，帕罗西汀对GRK2的抑制作用减弱，提示帕罗西汀通过影响GRK2活力阻止T细胞迁移。
　　8.帕罗西汀对脾脏T细胞MAPK信号通路的影响
　　CIA脾脏T细胞p38 MAPK和ERK活性明显升高，JNK活化不明显，帕罗西汀可显著抑制ERK的磷酸化，MTX对MAPK信号通路的活性没有明显影响。
　　结论：
　　1.帕罗西汀可有效改善大鼠CIA。
　　2.帕罗西汀减少CIA大鼠T细胞在滑膜组织中浸润，并抑制T细胞的活化和分化。