MERS冠状病毒3C样蛋白酶生物学功能研究

摘要

背景：中东呼吸道综合征冠状病毒（Middle East Respiratory Syndrome，MERS-CoV）是人类新发冠状病毒，首次被Zaki小组从沙特阿拉伯一名患有呼吸道感染和肾功能衰竭的老年患者体内分离出来，并于2012年9月确诊。目前中东呼吸综合征冠状病毒（MERS）造成1952人感染，其中693例死亡，死亡率高达36%，对人类生命和健康构成严重威胁。MERS复制酶聚合体（Replicase complex，RC）的形成主要取决于木瓜样蛋白酶（Papain-like protease，PLpro）和3C样蛋白酶（3C-like protease，3CLpro），抑制这两种蛋白酶的激活可有效阻断病毒复制。冠状病毒木瓜样蛋白酶在宿主抗病毒天然免疫应答的调节中起重要作用，这是前期实验室研究的结果，但目前对冠状病毒3CLpro研究较少，其与抗病毒天然免疫反应的关系还不清楚。本课题将主要研究MERS3C样蛋白酶，深入研究其与宿主抗病毒天然免疫关系等生物学功能。
　　目的：从MERS3CLpro调控细胞内IFN表达机制及其在宿主细胞中是否诱导自噬进行研究，为探究人类新发MERS冠状病毒参与免疫反应机制提供理论依据。
　　方法：首先，合成MERS-CoV/SARS-CoV/NL63-CoV3CLpro，利用PCR定点突变试剂盒构建蛋白酶活性缺失突变体。其次，利用蛋白印迹法?双荧光素酶活性测定法?酶联免疫吸附法和实时定量PCR等研究技术，检测MERS3CLpro及突变体对干扰素水平以及泛素化蛋白的影响；利用免疫共沉淀技术研究3CLpro与RIG-I通路关键因子泛素化水平影响。为了研究冠状病毒3C样蛋白酶与细胞自噬的关系，将带有绿色荧光蛋白GFP基因的LC3B与MERS3CLpro转染于细胞中，通过细胞免疫荧光染色技术确定MERS3CLpro是否引起特征性GFP-LC3B点状聚集。其次，利用Western blotting和电镜技术检测3CLpro诱导自噬效应。为了探究自噬体产生机制，首先Western blotting技术检测自噬蛋白p62的表达情况；随后使用免疫荧光技术检测由3CLpro诱导的pmRFP-GFP-LC3绿色和红色点状荧光聚集。
　　结果：1.3CLpro是由人冠状病毒编码的新IFN拮抗蛋白：（1）通过双荧光素酶活性检测技术对3CLpro调控干扰素活性分析，发现MERS/SARS/NL633CLpro均可抑制RIG-IN介导以及仙台病毒刺激下细胞内干扰素激活活性，酶联免疫吸附测定和实时定量PCR检测结果进一步证实3CLpro抑制细胞内干扰素表达。同时检测3CLpro对关键蛋白介导的IFN信号通路的影响，结果显示3CLpro明显抑制IPS-1/ERIS/TBK1/IRF3/IRF7激活的干扰素产生;（2）对3CLpro干扰素拮抗活性的特异性研究发现，3CLpro两种蛋白酶活性突变体不抑制IFN表达，提示3CLpro抑制干扰素活性依赖于其催化活性位点。
　　2. MERS3CLpro是一种新DUB酶：（1）将MERS3CLpro分别与泛素分子HA-Ub，以及HA-Ub K48，HA-Ub K63基因转染HEK293T细胞，实验发现MERS3CLpro能有效地去除细胞内蛋白的泛素化修饰，证实MERS3CLpro具有细胞内去泛素化（DUB）活性，且3CLpro的DUB活性与其蛋白酶催化活性密切相关。使用表达纯化的3CLpro进行体外DUB实验进一步证实这一特性。（2）以类泛素分子（SUMO和ISG15）为作用底物，发现3CLpro具有去SUMO活性和去ISG活性，且其活性依赖于酶催化活性位点。
　　3. MERS3CLpro抑制IFN机制研究：利用免疫共沉淀技术检测，表明3CLpro通过抑制或减弱RIG-I／TBK1／IRF3等蛋白泛素化从而负调控干扰素表达，且其活性依赖于3CLpro酶催化活性位点。
　　4. MERS3CLpro是新发现的自噬诱导蛋白：（1） MERS3CLpro诱导eGFP-LC3B绿色荧光点状积累，MERS3CLpro诱导自噬微管蛋白1-轻链3（LC3-II）表达上调说明3CLpro可诱导自噬。电子投射电镜技术证实，3CLpro诱导细胞出现自噬体特征性双层膜结构，进一步证实3CLpro可激活自噬。（2）研究发现3CLpro诱导不完全自噬作用，MERS3CLpro诱导自噬具有依赖时间性且独立于其酶催化活性。（3）研究发现其它两种感染人的冠状病毒3CLpro如SARS和NL63等均诱导自噬产生，提示3CLpro诱导细胞自噬特性广泛存在于人类冠状病毒中。
　　结论：本课题研究发现了3CLpro调控宿主免疫反应及诱导细胞自噬等新型生物学功能。证实了MERS编码的3CLpro具有多方面功能，不仅参与负调控抗病毒天然免疫反应，还具有去泛素化酶（DUB）活性，此外3CLpro是一种冠状病毒来源的细胞自噬诱导蛋白。3CLpro参与抗病毒天然免疫反应相关机制表明，3CLpro利用可以去泛素化特性，减弱或抑制信号通路中关键因子的泛素化，负调控干扰素表达。本课题新发现冠状病毒蛋白酶3CLpro能诱导宿主产生自噬效应，为抗病毒药物的研究提供了理论依据。

目录

声明

中英文对照表

1 引言

2 实验材料

2.1 细胞株和主要质粒

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器和设备

2.4 常规试剂及配制

3 方法

3.1 SARS-CoV／NL63-CoV 3CLpro及其突变体的构建

3.2 报告基因双荧光素酶活性检测法

3.3 实时定量PCR实验

3.4 酶联免疫吸附实验

3.5 RIG-I通路信号蛋白激活的干扰素分析

3.6 Western blotting分析蛋白表达量

3.7 去泛素化活性检测

3.8免疫共沉淀技术检测蛋白泛素化水平

3.9检测自噬体形成

3.10 自噬标志蛋白LC3-II表达分析

3.11 检测自噬底物蛋白p62稳定性

3.12 免疫荧光技术检测自噬膜流（autophgic flux）

3.13 统计学分析

4 结果

4.1 MERS-CoV基因组结构和3C样蛋白酶

4.2 3CLpro是一种新IFN拮抗剂

4.3 MERS冠状病毒3C样蛋白酶是一种新去泛素化酶

4.4 3CLpro对调节蛋白（RIG-I／TBK1／IRF3）的去泛素化作用

4.5 3C样蛋白酶是一种新的自噬诱导蛋白

5 讨论

6 结论

参考文献

附录个人简历

致谢

综述:NLRP3炎性小体激活和调控病毒感染的机制研究进展