2-脱氧-D-葡萄糖对人脐静脉内皮细胞和血管瘤生长的抑制作用

摘要

研究背景：　　血管瘤是婴幼儿最常见的良性肿瘤,约60％位于头颈部,大多位置表浅,严重地影响美观,给患者带来巨大的心理压力。位于特殊部位的血管瘤可因出血、溃疡、感染或压迫等影响患者的生理功能,甚至危及生命。迄今对血管瘤的确切发病机制仍不清楚,临床上缺乏针对所有类型血管瘤的高效防治方法。因此研究出一种血管瘤的特效治疗方法有非常重要的临床意义。　　2-脱氧-D-葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)是一种葡萄糖类似物,它可以通过抑制糖酵解途径、N-连接糖基化途径及诱导细胞凋亡的作用来影响细胞生长的多个环节,2-DG联合其它抗肿瘤治疗的方法可使疗效更加显著。　　实验目的：　　本课题通过体内、体外两部分实验的观察,对2-DG治疗婴幼儿血管瘤的作用进行初步探索,通过观察2-DG在体外对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移、成管及细胞凋亡的影响,研究2-DG对人脐静脉内皮细胞的生物学作用;通过观察2-DG在体内对移植瘤体积及细胞形态和组织结构的影响,研究2-DG在体内对血管瘤生长的作用,为临床上血管瘤的治疗探索新的途径。　　实验方法：　　1.MTT比色实验。将HUVECs接种于96孔板,加入含0mM、0.06mM、0.6mM、6mM、9mM2-DG的ECM,检测第二天、第三天和第四天各组的吸光度值。　　2.倒置显微镜细胞形态学实验。将HUVECs接种于六孔板,加入含0mM、0.06mM、0.6mM、6mM、9mM2-DG的ECM,分别于0h、24h、48h观察细胞数量和形态变化。　　3.体外划痕实验。将HUVECs接种于六孔板,加入20μL丝裂霉素C,划痕,再加入含0mM、0.06mM、0.6mM、6mM、9mM2-DG的ECM,分别于0h、12h用倒置显微镜观察并拍照。　　4.Matrigel成管实验。将50μLMatrigel平铺于96孔板,接种HUVECs,再加入含0mM、0.06mM、0.6mM、6mM、9mM2-DG的ECM,分别于0h、12h用倒置显微镜拍照并观察。　　5.流式细胞实验。将HUVECs接种于六孔板,加入含0mM、0.06mM、0.6mM、6mM、9mM2-DG的ECM,24h后进行预处理,再加入5μL FITC Annexin V、5μL PI及400μL Bing Buffer,用流式细胞仪检测并分析。　　6.构建裸鼠血管瘤模型。将切成0.8cm×0.6cm×0.6 cm的瘤体小块移植于裸鼠左、右腰背部皮下,于瘤体离体后1小时内完成。　　7.测量瘤体体积。给药后每隔两天用游标卡尺测量移植瘤的体积,并绘制瘤体生长曲线。　　8.病理组织学观察。给药后第35天取出移植瘤,10%甲醛固定,石蜡包埋,切片,HE染色,在400×光学显微镜下观察移植瘤的组织结构和细胞形态的变化。　　9.CD31免疫组化检测和阳性细胞计数。给药后第35天取出移植瘤,10%甲醛固定,石蜡包埋,切片,用鼠抗人的CD31单克隆抗体标记,于400×光学显微镜下观察并统计阳性细胞数。　　实验结果：　　在体外实验中,可观察到2-DG作用HUVECs12h时有显著抑制其成管、迁移的作用,在6mM2-DG的作用下HUVECs不能形成连续的管腔结构;在细胞迁移实验中,对照组的HUVECs迁移入整个划痕区,而6mM实验组的细胞迁移率不超过50%;2-DG作用HUVECs24h可诱导其凋亡,6mM和9mM2-DG有显著诱导HUVECs凋亡的能力,凋亡率分别为21.77%和25.07%,而对照组的细胞凋亡率为10.63%。倒置显微镜下细胞形态学实验表明对照组的细胞数量呈持续性增多的趋势,细胞为梭形,呈铺路石样生长,而实验组的细胞数量则有不同程度的减少,细胞形态亦发生明显改变,镜下可见大量受损细胞和脱落细胞。72h时MTT试验显示,与对照组的高细胞活力相比,0.6mM2-DG对HUVECs的增殖有抑制作用,6mM和9mM2-DG的抑制能力更加明显,均在60%以上。　　在体外实验中,可观察到2-DG对移植瘤的生长有明显的抑制作用,对照组裸鼠的移植瘤体积呈逐渐增大的趋势,而实验组的移植瘤体积则缓慢地减小,对照组的病理切片可观察到典型的血管瘤镜下表现,内皮细胞增殖并形成大量管腔样结构,而实验组的管腔结构明显较少,仅为对照组的一半,炎性细胞增多,大量纤维组织和脂肪组织浸润。　　结论：　　本研究通过体外细胞实验发现2-DG能显著抑制HUVECs的增殖、迁移和成管,使细胞形态发生明显改变,同时能诱导HUVECs的凋亡;体外实验中2-DG能使移植瘤体积减小,管腔样结构明显减少,纤维组织增生,脂肪浸润。说明2-DG有抑制内皮细胞和移植瘤生长的作用,为研究血管瘤的治疗提供了新思路。

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前言

文献回顾

1 血管瘤

1.1 概述

1.2 血管瘤的病理特征

1.3 血管瘤的临床表现

1.4 血管瘤的诊断

1.5 血管瘤的发病机制

1.6 血管瘤的治疗

2 脱氧-D-葡萄糖

2.1 概述

2.2 2-DG的作用机制

2.3 2-DG的安全性和可行性

2.4 2-DG与婴幼儿血管瘤

正文

第一部分 2-脱氧-D-葡萄糖对人脐静脉内皮细胞的生物学抑制作用

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二部分 2-DG抑制裸鼠血管瘤生长的研究

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢