动力相关蛋白1对高糖导致的心肌损伤的保护作用研究及其新机制：激活线粒体自噬

摘要

根据国际糖尿病联盟组织（The International Diabetes Federation,IDF）发布的最新数据，全球糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）患者已达4.15亿，预计至2040年患病人数将增加至6.42亿。以上数字还不包括被诊断为“未确诊糖尿病”（Undiagnosed Diabetes Mellitus,UDM）的患者,这部分患者在未来都有可能发展成为糖尿病患者。DM已成为世界严重的健康问题，给世界带来了巨大的经济负担，因此糖尿病也越来越值得我们关注。根据IDF提供的数据，我国约有1.1亿糖尿病患者，患者数量居世界第一。　　糖尿病（DM）以糖代谢紊乱为主要特征。DM常累及患者全身多个系统和器官组织，例如心血管系统、脑血管系统、泌尿系统、外周神经系统等等。其中心脑血管并发症是DM的高危并发症，是其高致残率与高致死率的主要原因。虽然DM的危害性已被人们逐渐意识到，但是对DM的并发症防治的方法与策略仍然有限。自噬是细胞通过溶酶体清除细胞内衰老和损伤的蛋白质及细胞器的过程，是一种细胞内非常保守的自我清除过程。细胞通过清除这些有害物质，抑制这些损害因子所介导的细胞死亡，维持细胞结构和功能的正常。自噬水平的降低可以导致多种疾病的病理过程。自噬分选择性自噬和非选择性自噬。作为心肌能量供应的唯一来源，受损线粒体的清除对于维持心肌细胞正常的功能具有举足轻重的作用。　　糖尿病心肌病的发病机制复杂，线粒体功能障碍可能是其主要发病机制之一。线粒体功能障碍引起呼吸链功能受损、氧化磷酸化水平降低最终导致心肌细胞凋亡。损伤线粒体的异常堆积，加重了氧化应激，进一步降低了氧化磷酸化水平。因此损伤线粒体的有效清除即线粒体自噬（Mitophagy）很有可能在糖尿病心肌损伤中起重要作用。线粒体自噬的调控机制复杂，目前仍未十分明确，然而阐明线粒体自噬的调节机制，对于疾病的治疗与预防至关重要。当前研究表明， Drp1(Dynamin-related protein1)即DNM1L（Dynamin-1-like protein）分子在缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion，IR）损伤中，通过上调自噬水平，有效清除损伤线粒体，维持线粒体动态平衡，从而对缺血再灌注所致的损伤起到有效的保护作用。然而在自噬水平下调的糖尿病心肌病中Drp1的作用及其对自噬的调节目前尚不清楚。因此，我们设想在糖尿病心肌病中，Drp1提高线粒体自噬水平，从而维持心肌细胞内的线粒体动平衡，使细胞内能量代谢近乎守恒，达到对糖尿病心肌病的保护作用。　　综上所述，通过本次实验我们主要解决以下问题，明确Drp1在糖尿病心肌病中的作用并进一步揭示Drp1保护心肌的作用机制。　　目的：　　1．构建糖尿病心肌病模型，观察糖尿病对心肌的结构和功能的作用，以及对心肌细胞线粒体自噬水平的影响；　　2．确定糖尿病对心肌细胞Drp1的表达的影响，在糖尿病心肌病的发生、发展中的作用；　　3．探讨Drp1对糖尿病心肌病导致的心功能异常及线粒体自噬障碍的影响，阐明Drp1对糖尿病心肌病保护作用的机制。　　研究方法：　　1.8-12周龄C57和Drp1-KO雄性小鼠，分别随机分为对照组即非糖尿病组和糖尿病组，糖尿病组给予腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）50mg/+kg，连续注射五天，自最后一次注射7天后，通过取小鼠鼠尾静脉血，用血糖仪测小鼠随机血糖，如连续两次测得小鼠不同时间的随机血糖均＞11.1mmol/L，为造模成功。将造模成功的小鼠与对照组小鼠，在完全相同的条件下饲养3个月，心脏超声检测证实出现收缩、舒张功能异常，以此构建糖尿病心肌病模型。　　2.将C57小鼠和Drp1-KO小鼠随机分为四组，分别标记为：正常组（Con）、糖尿病组（DM）、Drp1敲除组（Drp1-KO）、Drp1敲除+糖尿病组（Drp1-KO+DM）。检测小鼠心肌细胞内自噬体数量、LC3免疫荧光的分布情况、自噬相关蛋白测定（P62、LC3）、观察心肌细胞形态、纤维化程度、观察心肌细胞内线粒体形态及分布水平和心肌细胞凋亡程度。　　3.通过Western blotting检测小鼠心肌细胞自噬相关蛋白水平；通过透射电镜及免疫荧光检测小鼠心肌细胞自噬体数量；通过免疫荧光观察LC3的分布情况。　　4.通过多普勒超声检查，检测各组小鼠的心脏功能。　　5.通过马松（Masson）染色，观察小鼠心脏组织纤维化水平。　　6.通过透射电镜，观察心肌细胞线粒体形态。　　7.通过线粒体染色（Mito-Tracker）染色，观察心肌细胞线粒体分布水平。　　8.通过TUNEL法，观察每组小鼠心肌细胞的凋亡程度。　　9.分离昆明子鼠原代心肌细胞，随机分为四组：正常糖组（NG，5.5mmol/L）、正常糖+Drp1过表达组（NG+Drp1-OE）、正常糖+Drp1过表达组+3MA（NG+Drp1-OE+3MA）、高糖组（HG，33mmol/L）、高糖+Drp1过表达组（HG+Drp1-OE）、高糖+Drp1过表达组+3MA（HG+Drp1-OE+3MA）。　　10.通过Western blotting检测小鼠原代心肌细胞自噬相关蛋白水平。　　11.通过TUNEL法，观察每组小鼠原代心肌细胞的凋亡程度。　　12.通过透射电镜及免疫荧光检测小鼠原代心肌细胞自噬体数量。　　13.通过JC-1染色，观察小鼠原代心肌细胞线粒体膜电位水平。　　14.通过LC3免疫荧光观察小鼠原代心肌细胞自噬水平。　　研究结果：　　1.与对照组相比，糖尿病组小鼠心功能减低、心肌纤维化水平升高、心肌细胞凋亡明显增加、线粒体蓄积；DRP1-KO组心功能减低、纤维化水平升高、线粒体数量明显增加、自噬水平降低；DRP1-KO+DM组心功能减低、纤维化水平升高、线粒体数量增加、自噬水平降低。与糖尿病组相比，DRP1-KO组心功能变化无统计学意义、纤维化水平降低、线粒体数量明显增加、自噬水平升高；DRP1-KO+DM组心功能减低、纤维化水平升高、线粒体数量增加、自噬水平降低。　　2.与NG组相比，HG组线粒体膜电位水平降低、自噬水平降低、细胞凋亡增高；Drp1-OE组自噬水平升高。与HG组相比，HG+Drp1-OE组线粒体膜电位水平升高、自噬水平升高、细胞凋亡数明显降低。　　结论：　　本课题证明了动力相关蛋白1（Drp1）通过诱导线粒体自噬对糖尿病心肌病起保护作用。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

1. 糖尿病心血管并发症及发病机制

2. 糖尿病心肌缺血再灌注（I/R）损伤与糖尿病心肌病（DCM）

3. 自噬在心脏疾病中的作用

4. DRP1、线粒体自噬与心血管疾病

第一部分 Drp1基因敲除对糖尿病心肌病的影响

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第二部分 Drp1基因过表达对高糖环境下心肌细胞的影响

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢