构建BVDV E2靶向表达的干酪乳杆菌重组菌株

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第一章 综述

1.1 BVDV研究概况

1.1.1牛病毒性腹泻（BVD）

1.1.2 BVDV病原学

1.1.3 BVDV疫苗研究概况

1.2干酪乳杆菌疫苗载体的研究进展

1.2.1干酪乳杆菌作为新型载体的优势

1.2.2干酪乳杆菌UPP基因及其作用

1.2.3基因重组研究进展

1.3研究目的及意义

第二章 BVDV E2靶向表达的干酪乳杆菌UPP敲除质粒构建

2.1 实验材料

2.1.1载体、菌株

2.1.2主要仪器设备

2.1.3实验试剂

2.1.4溶液配制

2.2实验方法

2.2.1BVDV E2 UPP敲除质粒构建流程

2.2.2构建BVDV E2-GFP融合基因

2.2.3BVDV E2-GFP融合基因 PCR产物鉴定、胶回收与纯化

2.2.4slpA启动子基因片段扩增

2.2.5slpA启动子PCR产物鉴定、胶回收与纯化

2.2.6UPP两侧同源臂基因片段扩增

2.2.7UPP两侧同源臂PCR产物鉴定、胶回收与纯化

2.2.8pUC18与UPP上游同源臂（UPP-u），slpA PCR胶回收产物双酶切及产物回收

2.2.9pUC18与UPP-u和slpA PCR融合片段酶切回收产物连接

2.2.10UPP-u和slpA重组质粒的转化和阳性菌落鉴定

2.2.11 pUC18与upp下游（UPP-d）同源臂PCR胶回收产物双酶切及产物回收

2.2.12pUC18与UPP-d酶切胶回收产物连接

2.2.13UPP-u和slpA重组质粒的转化和阳性菌落鉴定

2.2.14pUC18-UPP-d质粒提取

2.2.15pUC18-UPP-d质粒酶切鉴定

2.2.16pUC18-UPP-d质粒质粒测序及比对

2.2.17pUC18及BVDV E2-GFP融合基因胶回收产物双酶切及产物回收

2.2.18pUC18及BVDV E2-GFP融合基因酶切回收产物连接

2.2.19pUC18-BVDV E2-GFP重组质粒的转化和阳性菌落鉴定

2.2.20pUC18-BVDV E2-GFP质粒提取

2.2.21pUC18-BVDV E2-GFP质粒酶切鉴定

2.2.22pUC18-BVDV E2-GFP质粒质粒测序及比对

2.3实验结果

2.3.1BVDV E2-GFP融合基因合成

2.3.2pUC18-UPP-d阳性菌落及双酶切测序鉴定

2.3.3pUC18-UPP-u-slpA阳性菌落及双酶切测序鉴定

2.3.4pUC18-BVDV E2-GFP阳性菌落及双酶切测序比对鉴定

2.3.5pUC18-pgsA-rrnBT1T2测序鉴定结果

2.4讨论

第三章 BVDV E2靶向表达干酪乳杆菌重组菌株构建和筛选

3.1 实验材料

3.1.1菌株、载体

3.1.2实验仪器

3.1.3实验试剂

3.2 实验方法

3.2.1真空冷冻干燥干酪乳杆菌菌种的恢复培养

3.2.2干酪乳杆菌感受态的制备

3.2.3电转化

3.2.4重组菌株阳性PCR鉴定

3.2.5重组菌株Western Blot检测蛋白表达

3.3 实验结果

3.3.1重组菌落PCR鉴定

3.3.2BCA蛋白浓度结果

3.3.3重组干酪乳杆菌蛋白Western Blot结果图

3.4 讨论

4.1 实验材料

4.1.1实验材料和仪器

4.2实验方法

4.2.1BVDV免疫小鼠

4.2.2小鼠攻毒保护力检测

4.3实验结果

4.4讨论

第五章 重组干酪乳杆菌对BVDV的保护力初步研究

5.1实验材料

5.1.1实验材料和仪器

5.2 实验方法

5.2.1干酪乳杆菌重组菌株免疫小鼠

5.2.2小鼠攻毒保护力检测

5.3实验结果

5.4讨论

结论

参考文献

致谢