桦褐孔菌深层发酵培养基的优化及甾醇类化合物的调控

摘要

桦褐孔菌(Inonotusobliquus(Fr.)Pilat),是珍稀的大型药用真菌,在俄罗斯已有一百多年的应用历史,能治疗多种疾病.目前美国、韩国及日本正加大对这种菌的研究,而我国尚处于初级研究阶段.自美国的HumfeldH等对蘑菇的深层发酵进行了研究,并提出用发酵法来培养蘑菇的菌丝体后,研究者们纷纷用这种方法进行多种菌类的发酵.而国内外对桦褐孔菌的深层发酵研究甚少,国内目前仅有一篇生物量方面的报道.对于其化学成分分析、调控及药理学方面的研究尚属空白.
　　本文通过对野外采集的桦褐孔菌菌核体进行组织分离,得到PDA菌种,然后对该菌进行深层发酵培养.为了得到大量的菌丝体和多糖,应用单因子试验和正交试验相结合分别得到菌丝体和多糖的优化培养基,并用DNS法测定发酵液中还原糖浓度;石油醚提取菌丝体中弱极性物质各成分后用GC-MS对其分析和鉴定.在此试验基础上,为了提高菌丝体中甾醇类化合物含量,首先优化了甾醇类化合物合成培养基,并通过人工干预该类化合物合成途径关键酶,对甾醇类化合物进行上调因子调控研究,以达到进一步提高甾醇类物质含量的目的,结果均用GC-MS分析.同时,对发酵胞内多糖进行了药理学研究,结果用试剂盒检测.得出结论如下:
　　1.在所选的几种碳、氮源中,葡萄糖是桦褐孔菌菌丝体生长、胞内粗多糖和甾醇类化合物合成的最佳碳源,麦芽糖是胞外粗多糖合成的最佳碳源;蛋白胨和酵母膏的混合物是最佳氮源;起始pH5.5最适合菌丝体生长,起始pH6.5最有利于胞内、外粗多糖和甾醇类化合物的合成.
　　2.3％的葡萄糖最适合菌丝体生长和胞外粗多糖的合成,0.4%的蛋白胨和0.2%的酵母膏最适合菌丝体的生长,0.6%的蛋白胨和0.3%的酵母膏最有利于胞外粗多糖的合成.
　　3.菌丝体最佳培养基配方组成为:2.5%葡萄糖,0.4%蛋白胨,0.2%酵母膏,起始pH为5.5;胞外粗多糖最佳培养基配方为:3.5%葡萄糖,0.6%蛋白胨,0.2%酵母膏,起始pH为6.5.
　　4.在菌丝体最佳发酵培养基中,还原糖的利用率达99.9%,pH由5.48降至4.09,最高菌丝体干重可达10.26g/L.
　　5.发酵菌丝体与野生子实体的弱极性组成成分存在一定差异.其中,羊毛甾醇是野生子实体中的主要成分,而菌丝体中芳香类化合物和麦角固醇是主要成分.
　　6.4.5mMCa2＋对麦角固醇和羊毛甾醇上调最显著,其含量分别为2.54mg/g和0.48mg/g,同时能获得9.4g/L的干重菌丝体.
　　7.8.0μM的Cu2＋不仅对麦角固醇和羊毛甾醇有显著的提高作用,同时不影响菌丝体生长,其中,两种甾醇的含量分别为2.88mg/g和1.32mg/g.
　　8.7.0×10-7μM的Ag＋对麦角甾醇的影响最显著,含量达2.72mg/g,而2.94×10-5μM的Ag＋能使羊毛甾醇的含量提高到2.05mg/g,菌丝体随着Ag＋浓度的增加而不断的减少,最大值与最小值之间相差2.10g/L.
　　9.当麦芽糖或葡萄糖作碳源,蛋白胨和酵母膏作混合氮源时,其发酵产物中的胞内多糖能显著刺激巨噬细胞释放TNFa.

目录

答辩

目 录

第一章前 言

1 桦褐孔菌的生物特性及研究现状

2 桦褐孔菌的药理作用

3 本课题研究的目的、意义和主要内容

第二章桦褐孔菌深层发酵培养条件的研究

第一节桦褐孔菌菌种的分离与纯化

1 材料与方法

2 结果与讨论

第二节桦褐孔菌深层发酵培养基的优化

1 材料与方法

2 结果与讨论

3 结论

第三章野生桦褐孔菌及其深层发酵产物的弱极性成分研究

1 材料与方法

2 结果与讨论

3 结论

第四章甾醇类化合物生物合成调控

第一节甾醇类化合物合成培养基的优化

1 材料与方法

2 结果与讨论

第二节甾醇类化合物的调控研究

1 材料与方法

2 结果与讨论

3 结论

第五章桦褐孔菌深层发酵胞内多糖的药理学研究

1 材料与方法

2 结果与讨论

3 结论

结论与展望

参考文献

致谢

附: 本人在读期间发表科研论文及获奖情况一览表