基因芯片快速诊断中枢神经系统细菌感染

摘要

研究背景： 中枢神经系统感染是神经系统的常见疾病。近年来，由于临床诊断策略的改进、疫苗接种及大量广谱抗生素的应用，细菌性感染的病死率明显下降。然而，随着社会经济的迅速发展，人员流动性明显增大，加之严重的环境污染、交通事故致脑外伤发生率增高等，中枢神经系统细菌感染率呈上升趋势。细菌性脑膜炎仍位居世界感染性疾病病死率的前十位，且因病原菌诊断困难、治疗延误及滥用抗生素等，约25％～50％的细菌性脑膜炎存活者仍遗留肢体活动障碍、失语、癫痫、智力障碍等后遗症。本病最常见的病原菌为脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌B型，病死率分别为10.3％、26.3％及6.0％。近年来结核性脑膜炎亦呈死灰复燃之势。快速、准确地诊断病原菌，早期合理应用抗菌药物迅速控制病情，是降低死亡率、防止并发症的最有效措施。临床病原菌诊断的“金标准”为细菌培养，但由于某些细菌生长困难、培养要求条件太高、培养前已经应用抗生素等原因，细菌培养的阳性率极低，国外报道只有3.1％～8.3％，且培养周期长，一般需24～48h，而结核分枝杆菌则需2～6周。因此，目前临床工作中，大多依据临床表现、脑脊液的细胞学、生化、免疫学检查及血常规等综合指标，推测细菌或其它致病源感染的可能性。由于病原菌诊断方面的限制，从某种程度上，滥用抗生素已经成为临床工作者的无奈之举，不但误诊及漏诊的发生率增高，而且造成医疗资源的极大浪费。本实验应用16SrDNA这一保守系列，根据其高度恒定序列设计一对共有引物，选择中枢神经系统感染的11种常见病原菌包括脑膜炎萘瑟(氏)菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希杆菌、绿铜假单胞菌、流感嗜血杆菌B型、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、甲型溶血性链球菌、粪肠球菌、肺炎链球菌及结核分枝杆菌，通过优化PCR条件，应用不对称PCR，分别对以上标准菌进行扩增。同时，依据16SrDNA的可变序列，设计3组探针，第1组为针对所有细菌的共有探针，第2组针对革兰阳性、革兰阴性细菌，用于对革兰阳性及革兰阴性菌进行筛选检测，第3组分别针对脑膜炎萘瑟(氏)菌、大肠埃希杆菌、流感嗜血杆菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌及结核分枝杆菌，将这10种探针集成到基因芯片上，与共有引物扩增的PCR产物，进行反向杂交，通过基因芯片扫描仪对杂交结果进行分析，从而在基因水平对致病细菌作出快速诊断。本实验共分三部分 一、多聚酶链反应扩增细菌16SrDNA 二、基因芯片快速检测常见致病菌 三、基因芯片技术在细菌性脑膜炎常见病原菌诊断中的应用 第一部分：多聚酶链反应扩增细菌16SrDNA 研究目的： 1．建立一种PCR扩增细菌染色体16SrDNA的优化技术体系。 2．检测PCR扩增反应体系的特异性及敏感性。 3．探讨不对称PCR对16SrDNA扩增的影响，为后续进行的基因芯片杂交打下基础。 结论 1 本实验设计的16SrDNA PCR技术体系，对11种常见细菌性脑膜炎致病菌扩增后，均出现特异扩增条带，而对单纯疱疹病毒，扩增结果为阴性。证实本 方法具有较高的特异性。 2 倍比稀释显示本扩增体系检测出的最低细菌菌落总数(colony forming unit，CFU)为37CFU/ml，提示本检测技术具有较高的敏感性。 3 本实验首次应用引物浓度不对称性PCR，对脑膜炎致病菌进行扩增，引物浓度为1∶5的不对称性PCR仍具较好的扩增效果。 第二部分：基因芯片快速检测常见致病菌 研究目的： 1．建立一种生物素标记的基因芯片检测常见神经系统感染致病菌的技术方法。 2．检测基因芯片对中枢神经系统致病菌的特异性及敏感性。 3．探讨提高基因芯片杂交效率的方法，为临床应用该技术诊断中枢神经系统细菌性感染提供实验依据。 结论 1 本实验应用生物素标记的7种标准菌不对称PCR产物，进行芯片杂交，6种细菌均在相应的共有探针、革兰氏阳性或革兰氏阴性及各自的探针区，检测出特异的杂交信号。提示该体系具有较优化的杂交条件。 2 细菌PCR混和产物杂交结果，证实该杂交体系具有较强的特异性。 3 本杂交体系能够检测出的细菌最低稀释度为10<'-7>，提示芯片杂交较PCR具有更强的敏感性。 4 生物素标记的标准菌样本，杂交后肉眼即可观察结果，经芯片识读仪扫描后，杂交信号清晰、灵敏，且操作简单、经济实用，该标记方法具有 较好的临床应用前景 5 实验从杂交、显色，至最终读片、得出杂交结论，仅需2小时，操作较简单，杂交信号直观，具有较高的临床实用价值。 第三部分 基因芯片技术在细菌性脑膜炎常见病原菌诊断中的应用 研究目的： 检测基因芯片对临床脑脊液样本中致病菌诊断的特异性及敏感性。为该技术在临床的广泛应用提供可靠的实验依据。 结论 1．16SrDNA扩增对脑脊液细菌检测的敏感性，显著高于细菌培养。 2．基因芯片杂交结果与细菌培养诊断符合率为100％；提示该技术具有较高的 特异性。 3．本实验建立的杂交体系，能在4小时内对常见脑膜炎细菌作出病原学诊断，操作简单、经济，具有较广阔的临床应用前景。

目录

原创性声明及关于学位论文使用授权的声明

英文缩略词语中英文对照

第一部分多聚酶链反应扩增细菌16SrDNA

第二部分基因芯片技术快速检测常见致病菌

第三部分基因芯片技术在细菌性脑膜炎常见病原菌诊断中的应用

致 谢

博士研究生期间发表论文