问号钩端螺旋体两种不同类型异柠檬酸脱氢酶的功能鉴定

摘要

异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase, IDH)作为三羧酸循环(tricarboxylic cycle, TCA cycle)中的关键酶,普遍存在于动植物和古菌等各种生物体中。根据分子系统发育分析,IDH可以分为两类:I型(Type I)和II型(Type II)。根据辅酶特异性的不同,IDH又可以分为:NAD+依赖型IDH(NAD-IDH)和NADP+依赖型IDH(NADP-IDH)。目前发现Type I中包含NAD-IDH和NADP-IDH,但Type II中仅包含NADP-IDH。
　　问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans serovar Lai str.56601)含有两种不同类型的IDH基因,分属于Type I和Type II,简称LiIDH-I和LiIDH-II,且它们的功能研究均未见报道。本研究对LiIDH-I和LiIDH-II基因进行了扩增和克隆,并在原核表达系统中实现了高效异源表达,然后对LiIDH-I和LiIDH-II的功能进行了鉴定。
　　LiIDH-I的功能鉴定。SDS-PAGE显示,纯化后的LiIDH-I亚基分子量大约为53.8 kDa。凝胶过滤层析结果显示:在溶液中加入甘油时, LiIDH-I的分子量为294 kDa,且活性稳定;而不加入甘油时,LiIDH-I的分子量为127 kDa,但没有活性,因此LiIDH-I的活性形式是同源六聚体。酶学性质研究发现,LiIDH-I与其它典型的二聚体IDH一样都是二价金属离子依赖性酶,Mn2+是最适激活剂,其次是Mg2+,但受到Cu2+、Zn2+、Ni2+和Ca2+的强烈抑制。在以Mg2+或Mn2+为激活剂时,LiIDH-I的最适pH分别为8.0和7.0,最适温度分别为55°C和25°C。热稳定性研究发现, LiIDH-I在50°C条件下孵育20 min,残留约一半的活性。酶动力学参数研究发现,在Mg2+或Mn2+条件下, LiIDH-I对辅酶NAD+的Km值分别为84.68μM和149μM,这要稍低于来自猪链球菌(Streptococcus suis)(Km值分别为233μM和174μM)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(Km值分别为245μM和312μM)的二聚体NAD-IDH,但是要高于来自氧化硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)(在Mg2+条件下,Km值为180μM)和强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(在Mg2+条件下,Km值为68.3μM)的NAD-IDH。在Mg2+或Mn2+存在的条件下,LiIDH-I对辅酶NAD+的催化效率分别是其对辅酶NADP+的97倍和58倍,故LiIDH-I可同时以NAD+和NADP+为辅酶,但其对辅酶NAD+具有更高的亲和力。
　　LiIDH-II的功能鉴定。SDS-PAGE显示,纯化后的LiIDH-II亚基分子量大约为44.7 kDa,凝胶过滤层析显示,LiIDH-II的分子量约为87 kDa,所以LiIDH-II是典型的二聚体IDH。在以Mg2+或者Mn2+为激活剂时, LiIDH-II的最适pH分别为8.0和7.0,最适温度均为60°C。热稳定性研究发现,LiIDH-II在50°C条件下孵育20 min,残留约一半的活性。LiIDH-II与其它典型的二聚体IDH一样都是二价金属离子依赖性酶,Mg2+是最有效的金属离子激活剂,它的部分功能能够被Mn2+和Co2+取代,例如Mn2+和Co2+分别能够承担Mg2+功能的63％和52%。在Mg2+或Mn2+条件下, LiIDH-II对辅酶NADP+的Km值分别为21.1μM和37.94μM,这与来自海栖热袍菌(Thermotoga maritime)(在Mg2+条件下,Km值为55.2μM)和大肠杆菌(Escherichia coli)(在Mg2+条件下,Km值为17μM)的二聚体NADP-IDH结果相似,但是要高于来自阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)(在Mn2+条件下,Km值为4.9μM)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)(在Mg2+条件下,Km值为2.42μM)和棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)(在Mg2+条件下,Km值为5.8μM)的单体NADP-IDH,说明单体IDH对于NADP+的亲和性要明显高于二聚体NADP-IDH。由于辅酶亲和性的降低,二聚体NADP-IDH的催化效率(kcat/Km)与单体NADP-IDH相比非常低,例如在Mg2+存在的条件下,LiIDH-II和E. coli IDH的催化效率分别为1.21μM-1s-1和4.7μM-1s-1,而S. avermitilis IDH和A. vinelandii IDH的催化效率分别为11.7μM-1s-1和15.9μM-1s-1。酶动力学参数研究发现,在Mg2+或Mn2+存在的条件下,LiIDH-II对辅酶NADP+的催化效率分别是其对辅酶NAD+的6269倍和1000倍。
　　此外,在Mg2+或Mn2+条件下,LiIDH-I对底物异柠檬酸的Km值分别为76.63μM和85.15μM, LiIDH-II对底物异柠檬酸的 Km值分别为7.336μM和2.842μM,因此LiIDH-II对异柠檬酸的底物亲和性要远远高于LiIDH-I。
　　目前对NADP-IDH的空间结构、催化及调节机制的研究已经十分广泛,然而关于NAD-IDH催化机制的研究却相对较少。因此,本实验对于LiIDH-I的研究不仅有助于丰富 NAD-IDH的酶学性质研究,而且为NAD-IDH的空间结构以及催化机制研究提供有用的信息。
　　近年来虽然对钩端螺旋体进行了大量的细胞及分子生物学研究,但是对于问号钩端螺旋体致病机制的了解却很少。本研究对问号钩端螺旋体LiIDH-II的研究,将有助于丰富原核生物Type II NADP-IDH的基础信息,为此类IDH的三维空间结构和催化机制奠定基础。此外,本研究还能够为将IDH作为钩端螺旋体病的候选诊断标靶提供一定的参考。

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第一章 综 述

1. 问号钩端螺旋体

1.1 问号钩端螺旋体及钩端螺旋体病

1.2 钩端螺旋体病的致病机制

1.3 问号钩端螺旋体的异柠檬酸脱氢酶

2. 异柠檬酸脱氢酶

2.1 异柠檬酸脱氢酶的分类

2.2 IDH的空间结构

2.3 IDH的酶学性质

2.4 IDH的生物学功能

3. 研究意义和展望

参考文献

第二章 问号钩端螺旋体LiIDH-I的功能鉴定

1. 实验材料与方法

2. 实验结果

2.1 问号钩端螺旋体LiIDH-I重组表达载体的构建

2.2 问号钩端螺旋体LiIDH-I重组蛋白质的表达和纯化

2.3 问号钩端螺旋体LiIDH-I重组蛋白质的活性染色

2.4 问号钩端螺旋体LiIDH-I重组蛋白质的分子量测定

2.5 问号钩端螺旋体LiIDH-I重组蛋白质的酶学性质

3. 讨论

参考文献

第三章 问号钩端螺旋体LiIDH-II的功能鉴定

1. 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2. 实验结果

2.1 问号钩端螺旋体LiIDH-II重组表达载体的构建

2.2 突变体重组质粒pET-RH/DI的构建

2.3 问号钩端螺旋体LiIDH-II重组蛋白质及突变体的表达和纯化

2.4问号钩端螺旋体LiIDH-II重组蛋白质的活性染色

2.5 问号钩端螺旋体LiIDH-II重组蛋白质的分子量测定

2.6 问号钩端螺旋体LiIDH-II重组蛋白质的酶学性质

2.7 问号钩端螺旋体LiIDH-II序列同源性分析

3．讨论

参考文献

致谢

附：