出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7效应蛋白NleL和宿主蛋白ZBED1相互作用的发现与验证

摘要

出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7是一种食源性和水源性的病原菌,该菌通过III型分泌系统将效应蛋白注入至宿主细胞中产生粘附与脱落(A/E)损伤而致病,它的感染会导致出血性肠炎并极有可能出现致命的出血性尿毒综合症,是一种全球范围内高度关注的病原菌。NleL(non-lee-encoded-effector-Ligase)是由Ⅲ型分泌系统分泌的一种具有真核细胞泛素化E3连接酶活性的效应蛋白,然而它在宿主细胞内的底物和作用机制尚不清楚。
　　本文通过蛋白质表达重组子的构建、蛋白质的诱导表达与纯化、蛋白质细胞内定位、酵母双杂交、GST pull-down和体外泛素化等实验方法来筛选和验证效应蛋白NleL在真核细胞内的相互作用蛋白,取得了以下结果:
　　1.酵母双杂交实验筛选NleL可能作用于宿主的底物蛋白ZBED1
　　酵母双杂交实验初次筛选出可能与效应蛋白NleL相互作用的真核宿主细胞蛋白ZBED1,在SD-2和SD-4板均能生长的阳性克隆,经扩增、双酶切、测序分析比对后,发现的确是ZBED1序列,可初步推断宿主蛋白ZBED1与效应蛋白NleL之间有可能存在相互作用。
　　2. NleL(GST-NleL)蛋白的诱导表达与纯化
　　本研究成功纯化了带有 GST和 His双标签的 NleL的全长蛋白GST-NleL-His和其带单标签的片段 GST-NleL170-782-WT蛋白。结果表明,在纯化方法上用GST-beads纯化方法优于用Ni-NTA方法;纯化获得的NleL融合蛋白的纯度和质量也满足进一步实验的要求,融合蛋白可以冷冻储存为后续体外实验备用。
　　3.效应蛋白NleL与宿主蛋白ZBED1结合试验
　　用GST pulldown试验验证了宿主蛋白ZBED1与效应蛋白NleL的相互结合, western blot检测显示蛋白 GST-NleL-His与 NleL蛋白的片段GST-NleL170-782WT都与宿主蛋白ZBED1在体外产生较强的相互结合,由ZBED1与GST-NleL170-782WT的相互结合可以推测:效应蛋白NleL与宿主蛋白ZBED1相互结合的位点有可能位于第170-782氨基残基之间。
　　4.效应蛋白NleL与宿主蛋白ZBED1的体外泛素化试验
　　已有研究显示NleL具E3连接酶活性,且其泛素化的活性与第753位的半胱氨酸残基有关,本研究通过NleL与ZBED1体外泛素化实验探究了NleL是否通过该活性作用于底物ZBED1。结果表明,宿主蛋白ZBED1存在自泛素化现象,NleL全长蛋白融合蛋白GST-NleL-His、NleL的第753位点突变片段融合蛋白GST-NleL170-782C753A与底物ZBED1蛋白相互作用后,ZBED1的自泛素化作用明显减弱,效应蛋白 NleL可能是通过影响宿主蛋白 ZBED1的自泛素化作用而影响宿主细胞的生理活动;NleL的第753位点突变片段融合蛋白GST-NleL170-782C753A与未突变的全长蛋白作用效果相同,表明NleL蛋白不是通过E3连接酶的活性来影响ZBED1的生理作用的。
　　5.效应蛋白NleL在真核细胞内的表达与定位
　　明确效应蛋白NleL在细胞内的定位对于探究其在真核细胞中的作用机制是十分必要的。本研究成功构建出能够在真核细胞中表达带EGFP的NleL融合蛋白重组质粒 pCDNA3.0-UTR-EGFP-NleL-HA,将该质粒和对照质粒pCDNA3.0-UTR-EGFP-HA转染293T和Hela细胞后,观察显示NleL蛋白绝大多数定位在细胞质内,亦有少量进入到细胞核中;对照组EGFP荧光蛋白在整个细胞中均有分布,没有明显的细胞定位特异性。由此可推测,NleL效应蛋白进入真核细胞后,可能在细胞质中和细胞核中与不同的底物蛋白发挥不同的作用。
　　总之,本研究通过酵母双杂交系统首次成功筛选到效应蛋白NleL在宿主细胞中的潜在底物ZBED1,并且通过GST pull-down试验和与体外泛素化试验初步探讨了 NleL蛋白的相互作用,并明确了 NleL蛋白在真核细胞内的定位,为今后进一步探究该蛋白在真核细胞内的作用机理提供了线索。

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第一章 文献综述

第1节 出血性大肠杆菌（EHEC）O157:H7

1.1出血性大肠杆菌（EHEC）O157∶H7

1.2 出血性大肠杆菌EHEC O157:H7的发现及其流行性

1.3 出血性大肠杆菌（EHEC）O157:H7的主要毒力因子

1.4 出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7最新研究进展

第2节 Ⅲ型分泌系统与效应蛋白NleL

2.1 细菌Ⅲ型分泌系统是病原菌将效应蛋白输送到真核细胞的机器

2.2 NleL是一种具有E3连接酶活性的效应蛋白

第二章 效应蛋白NleL与宿主蛋白ZBED1相互作用的发现与验证

第1节 酵母双杂交实验筛选NleL作用于宿主的底物蛋白

1.1 实验材料和仪器

1.2 酵母双杂交实验筛选NleL作用于宿主的底物蛋白

1.3 试验结果与讨论

第2节 NleL(GST-NleL)的诱导表达和纯化

2.1 材料材料和仪器

2.2 EHEC O157效应蛋白NleL的诱导表达

2.3 融合蛋白GST-NleL-His的纯化

2.4 试验结果与讨论

第3节 效应蛋白NleL与宿主蛋白ZBED1结合与体外泛素化试验

3.1 实验材料和仪器

3.2 GST pull-down检测蛋白之间的作用

3.3 效应蛋白NleL与宿主蛋白ZBED1体外泛素化试验

3.4 Western blot检测信号

3.5 试验结果与讨论

第4节 效应蛋白NleL在真核细胞内表达与定位

4.1 实验材料和仪器

4.2 NleL真核表达重组质粒pCDNA3.0-UTR-EGFP-NleL-HA的构建

4.3 重组子pCDNA3.0-UTR-EGFP-Nlel-HA在真核细胞内表达与定位

4.4 试验结果与讨论

参 考 文 献

致谢

附：研究生期间撰写并发表的文章汇总