青檀微卫星位点的筛选及其种群遗传结构的研究

摘要

青檀(Pteroceltis tatarinowii Maxim.),我国特有的单型属树种,属于榆科(Ulmaceae)青檀属(Pteroceltis),是第三纪的残遗植物。该树种在我国温带和亚热带地区广泛分布,但多呈间断岛屿状。微卫星属于共显性分子标记,具有高度的多态性,目前被认为是最好的用于群体基因研究的孟德尔分子标记。本文利用磁珠富集法共筛选出了19个青檀多态性微卫星位点,并选取了其中的12个对广泛分布于我国的16个青檀种群的353个个体的遗传多样性和种群结构进行了比较分析。主要研究结果如下:
　　1.青檀微卫星位点的筛选
　　(1)本文采用磁珠富集法构建青檀微卫星文库,从中筛选出了23个微卫星位点标记。
　　(2)利用筛选出的23个微卫星位点对来自山东青檀寺(QTS)、云南鲁布格(LBG)和福建武夷山(WYS)3个野生种群的60份样本进行多态性的筛选。结果显示其中的19个位点具有较高的多态性,每个位点的等位基因数从5到17个不等,平均为8.632个。3个种群的平均等位基因数分别为5.000、5.263、4.947,平均期望杂合度分别为0.668、0.657、0.665,平均观察杂合度分别为0.646、0.619、0.641,平均多态信息含量分别为0.594、0.594、0.592。
　　(3)19个多态性位点的哈温平衡检测结果显示云南鲁布格种群(LBG)中位点 QT16和 QT18,福建武夷山种群(WYS)中位点 QT18显著偏离哈温平衡;连锁不平衡检测结果表明有2对位点显著连锁不平衡,分别是QT9/QT13和QT11/QT15。同时无效等位基因检测显示位点QT13和QT18在3个种群中都可能存在无效等位基因。
　　2.基于微卫星分子标记的青檀遗传结构研究
　　(1)选取其中的12对引物(QT1-12)对广泛分布于我国的16个青檀种群的353个个体进行遗传多样性和遗传结构的分析。结果显示,青檀各项遗传多样性参数均处于较高水平,表明青檀群体的遗传多样性较为丰富。
　　(2)12对引物对16个种群的哈温平衡检测结果显示QT3、QT9位点在广东南岭种群(NL),QT6位点在陕西略阳一里沟种群(YLG),QT7位点在云南罗平鲁布格种群(LBG)偏离哈温平衡;连锁不平衡检测检测结果显示QT1/QT8、QT2/QT7、QT3/QT7、QT7/QT11四个组合连锁不平衡;无效等位基因检测结果显示只有部分种群不存在无效等位基因,大部分种群在12个位点上都存在一定程度的无效等位基因。
　　(3)贝叶斯聚类分析、UPGMA系统树以及Gentix因子相关分析(FCA)都显示了一致的种群间聚类关系。16个种群被分为了三大类群。
　　(4)对各种群之间的遗传分化进行检测,结果显示66.7％的种群间出现了中等程度的分化,32.5%的种群间出现了明显的分化。同时,比较两两种群间基因流Nm发现,92.5%的种群间的基因流Nm值都大于1,平均基因流为1.518,分析认为,在短时间内基因流能够发挥一定的均质化作用从而抑制各地理种群间遗传分化的产生。
　　(5)AMOVA分析结果显示,整个青檀种群中的遗传变异87.29%(P<0.01)发生在种群内部,而种群间的遗传变异仅为12.71%(P<0.01)。由此可见,青檀的遗传变异主要存在于种群内。
　　(6)通过突变-漂变平衡检测可以看出,在TPM模型下LYS、YL、XN、QTS、DSY、YLG种群表现出了极显著的杂合缺失(P<0.01),表明这些群体在近期内可能经历过瓶颈效应的影响,其种群数量曾经下降过。
　　(7)对不同青檀种群的地理距离和遗传距离之间进行 Mantel相关性检验,结果显示二者之间呈现中度正相关性(r=0.375,P=0.004),符合距离产生分化模型(IBD)。

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第一章 研究背景

1 青檀的生物学特性及研究现状

2 微卫星分子标记简介

3 本文的研究目的和意义

第二章 青檀微卫星位点的筛选

1 实验材料

1.1 样品的采集

1.2 主要试剂

1.3 主要实验仪器

2 实验方法

2.1 基因组DNA的提取

2.2 微卫星文库的构建

2.3 引物的设计与检测

2.4 TP-M13-SSR技术应用于多态性微卫星位点的筛选

2.5 数据处理

3 实验结果与分析

3. 1 青檀基因组DNA的提取和酶切

3.2 酶切产物与接头连接后PCR扩增以及磁珠富集后PCR扩增

3. 3 菌落PCR 扩增检测

3.4 阳性克隆测序结果

3.5 引物的特异性扩增

3.6 TP-M13-SSR技术检测微卫星位点的多态性

4 讨论

4.2 磁珠富集

第三章 基于微卫星分子标记的青檀遗传结构研究

1 实验材料

2 实验方法

2.1 DNA提取

2.2 引物信息

2.3 PCR扩增

2.4 基因分型与信息读取

2.5 数据处理

3 实验结果与分析

3.1 种群遗传多样性分析

3.2 种群遗传结构分析

3.3 种群遗传分化分析

3.4 种群瓶颈效应分析

3.5 地理距离隔离检验

4 讨论

4.1 种群遗传多样性

4.2 哈温平衡

4.3 种群间遗传分化分析

4.4 种群瓶颈效应

4.5 地理距离隔离影响分析

4.6 青檀的保护策略

第四章 结 论

1 青檀微卫星位点的筛选

2 基于微卫星分子标记的青檀遗传结构研究

参考文献

致谢

附：