用于鉴定扶桑绵粉蚧物种以及分析种群的遗传多样性与种群结构的SSR引物

摘要

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及用于鉴定扶桑绵粉蚧物种以及分析种群的遗传多样性与种群结构的SSR引物。本发明在扶桑绵粉蚧随机基因组序列中共分离出115,639个微卫星位点，共筛选得到42对扩增效率高和多态性高的引物，本发明的扶桑绵粉蚧SSR引物标记类型丰富，扩增效率高。多态性强，标记甄别度高，为扶桑绵粉蚧遗传多样性、种群遗传结构、以及入侵路径等方面研究提供分子标记。

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及用于鉴定扶桑绵粉蚧物种以及分析种群的遗传多样性与种群结构的SSR引物。

背景技术

扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)，又称棉花粉蚧，属半翅目Hemiptera、粉蚧科Pseudococcidae、绵粉蚧亚科Phenacoccinae、棉粉属Phenacoccus，是一种世界性入侵害虫。为了更好的防控入侵物种，明确其遗传结构及扩散机制是必不可少的步骤。利用分子标记，研究种群遗传结构是较为普遍的方法。据研究报道，利用线粒体COXI和28SrDNA两种标记研究扶桑绵粉蚧遗传结构，发现其可能存在两条遗传谱系，至于是否为复合种，以及入侵路径如何，目前尚未明确。

微卫星是一种特殊的串联重复序列，其重复单元从1到6不等。它具有共显性遗传、多态性高、容易扩增等优点，已经广泛应用于种群遗传学相关研究中，但是，即便如此，微卫星的开发还是存在困难。如富集文库后进行基因克隆的传统的微卫星开发方法，需要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳加放射显影与银染的方法检测每一个微卫星标记位点，开发流程复杂，既费时又费力。而且传统的方法检测结果并不准确，准确的结果需要参考样本等进行校正。这就产生一系列的问题：(1)产生的可用微卫星标记数量少，导致建立的样本的DNA信息不完整。(2)开发的分子标记多态性低，对于检测结果不准确，序列侧翼保守性未知，影响微卫星分子标记的通用性。因此基于二代高通量测序新兴技术的广泛应用，开发出大量的微卫星分子标记就成为可能。利用二代高通量测序，从基因组的层面开发整个基因组的微卫星分子标记，高效省时，获得的标记多态性高，准确并且通用性好。

Li等利用ESTs开发了7对扶桑绵粉蚧微卫星标记，但是其中6对偏离哈迪温格尔平衡。楮栋等利用转录组信息，搜索到了三碱基重复最为丰富，但未对微卫星引物进行开发及验证。这两种标记均是基于编码基因开发的微卫星。本发明从基因组层面上进行微卫星开发，除了编码区域开发位点，还可以从非编码区找到大量的微卫星位点，设计出更有效的SSR引物。

本发明利用一段随机基因组序列，开发了扶桑绵粉蚧SSR引物。并利用实验室采集的3个地理种群的样本进行有效性验证，为后续的种群遗传多样性、种群遗传结构、以及入侵路径等研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供用于鉴定扶桑绵粉蚧物种以及分析种群的遗传多样性与种群结构的SSR引物。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

所述引物包含42对引物，引物序列如表1所示。

表1 42对扶桑绵粉蚧Phenacoccussolenopsis的SSR引物信息

本发明的优点在于：

基于二代高通量测序技术开发微卫星分子标记，利用本发明的微卫星分子标记，进行PCR扩增，GENEMAPPERv4.0分型得到基因型分布，通过Microsatellite-Tools和GENEPOP v4.0.11对基因型进行分析等位基因频率，杂合度以及多样性信息含量等遗传多样性指标，利用STRUCTURE v2.3.4和DAPC分析扶桑绵粉蚧种群遗传结构。

本发明基于二代测序技术，在基因组层面上，开发大量扶桑绵粉蚧SSR引物。并利用实验室采集的3个地理种群的样本进行有效性验证，为后续的遗传多样性、种群遗传结构、以及入侵历史等方面奠定基础。

本发明的扶桑绵粉蚧微卫星分子标记类型丰富，扩增效率高。多态性强，标记甄别度高，为扶桑绵粉蚧遗传多样性、种群遗传结构、以及入侵路径等方面研究提供分子标记。

附图说明

图1为扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis微卫星位点频次分布图；

图2显示42个扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis微卫星位点的中性检验；

图3显示扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis的种群遗传结构；

图4显示利用DAPC软件分析扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis的种群遗传结构。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行描述，以便更好的理解本发明。

本发明利用IlluminaHiseq 4000平台测序获得一段25.69GB的序列，读长为150bp，共包括插入DNA序列中的171,296,024个reads，评估基因组大小为261.61Mb。过滤掉较差的reads后，用高质量reads拼接成283,033个scaffold。得到的随机基因组序列总长为267.07Mb，最长的scaffold长度为317.8Kb，scaffoldN50达到14.12Kb。评估该随机序列基因组，其完整度为89.6％。

在上述扶桑绵粉蚧随机基因组序列中共分离出115,639个微卫星位点，发现2碱基重复(dinucleotide repeats，DNR)位点为5891(28.55％)个，3碱基重复(trinucleotiderepeats，TNR)位点为9012(43.68％)个，4碱基重复(tetranucleotide repeats，TTNR)位点为4904(23.77％)个，5碱基重复(pentanucleotide repeats，PNR)位点为764(3.70％)个，6碱基重复(hexanucleotide repeats，HNR)位点为61(0.30％)个(表2)。2碱基重复到6碱基重复的位点平均长度最小17bp，最大是54bp。频率和密度分别在0.18-26.7/Mb和9.9-522.907/Mb范围内。

适合引物设计的位点有28469个，但只实现转换了76对引物，经过8个个体对引物的初次筛选，共得到42对扩增效率高和多态性高的引物被，用于后续种群多态性验证(表1)。

实施例1

样本采集：随机序列基因组测序所用的扶桑绵粉蚧样本，来源于华中农业大学实验室室内饲养雌成虫。其他野外种群样本，于2017年8-9月，从扶桑绵粉蚧发生地区，采集扶桑绵粉蚧雌成虫，然后将其浸泡在无水乙醇中，于4℃冰箱保存。从这些扶桑绵粉蚧标本中分别选取8个不同地区的样本各1头，用于微卫星标记引物的初次筛选。

样本采集：本发明的随机序列基因组测序所用的扶桑绵粉蚧样本，选取江苏无锡(JSWX,120.282°E,31.487°N)、江西赣州(JXGZ,114.970°E,25.825°N)和广东广州(GDGZ,113.159°E,23.157°N)三个种群的扶桑绵粉蚧雌成虫，共72头，用作检验初筛所得微卫星标记位点的多态性。所有的样本均储存在北京农林科学院植物害虫综和防治研究室。

DNA提取与随机序列基因组组装：用DNeasy Blood&Tissue Kit试剂盒提取整头扶桑绵粉蚧雌成虫全基因组DNA，并建立一个插入片段为150bp的DNA文库。用Illumina Hiseq4000平台测序。测序得到的结果用FastQC进行质量控制，TRIMMOMATIC软件过滤掉较差的reads后，利用IDBA_UD软件进行拼接。利用JELLYFISH软件评估组装基因组大小，BUSCO评估基因组完整度。

微卫星特征分析与引物设计：对组装好的随机序列基因组进行微卫星位点搜索，单碱基重复、二碱基重复、三碱基重复、四碱基重复、五碱基重复和六碱基重复最小重复数分别为12,7,5,5,5,5。对重复基元进行统计时，把同一重复特征的碱基基元归为一类，如(ATC)n，(TCA)n，(CAT)n，(GAT)n，(TGA)n和(ATG)n，这6个重复单元均为一类，并统计微卫星位点的平均长度、数量、频率和密度。

在随机序列基因组内进行微卫星位点的检测并且设计出相应的引物序列。本发明的微卫星引物设计的标准优化为：(1)三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复以及六核苷酸重复基元分别要多于6、6、5、5个重复；(2)PCR产物的长度在100bp到350bp之间，最佳引物设计的长度为20bp；(3)退火温度范围为58.0-63.0℃；(4)成对上、下游引物之间退火温度差小于5℃。其他的参数为默认值。而且，按照严格的标准对引物进行筛选，只保留设计策略为“A”的引物，即选择没有多个微卫星位点，纳米卫星位点以及均聚物的引物，每对引物的3’端与目标区域的距离不大于10bp。

引物筛选与多态性检测：为了节约成本，提高效率，在每对候选的上游引物前加入了一段序列为5’-CAGGACCAGGCTACCGTG-3’的PC尾巴。引物初筛的8头样本来自不同地区的扶桑绵粉蚧雌成虫。扩增体系为10ul，包括0.5ul模板，5ul Master Mix，0.08ul上游引物，0.16ul下游引物，0.32ul荧光标记的PC引物和3.94ulddH

测序结果进行基因分型，确定后续实验引物，筛选标准如下：(1)保留PCR扩增效率大于75％的引物；(2)去除多态性较低的引物(allele低于2)；(3)基因分型时，弃去同一个体多于2个峰值的引物。符合条件的引物用于种群水平的试验，扩增体系、过程和PCR产物片段均同上。

数据分析:进行基因型分型之前，分析等位基因频率、观测杂合度(HO),期望杂合度(HE)和多样信息含量(PIC)等。分析每个位点在各个种群的哈迪温格尔平衡(Hard-Weinberg equilibrium，HWE)的偏离、连锁不平衡(Linkage disequilibrium，LD)、种群间遗传分化系数以及每个种群的近交系数(Inbreeding coefficient，FIS)。计算每个位点等位基因丰富度，并且对每对引物进行中性检验。分析种群遗传结构，数据模拟过程中MCMC(Markov chain Monte Carlo)次数为200000，burn-in次数为100000，利用在线软件Structure Harverster确定最精确的K值。我们还利用DAPC软件分析扶桑绵粉蚧种群遗传结构。

本发明获得一段25.69GB的序列，读长为150bp，共包括插入DNA序列中的171,296,024个reads，基因组大小为261.61Mb。过滤掉较差的reads后，用高质量reads利用IDBA_UD软件进行拼接成283,033个scaffold。得到的随机基因组序列总长为267.07Mb，最长的scaffold长度为317.8Kb，scaffoldN50达到14.12Kb，其完整度为89.6％。

微卫星位点特征：在扶桑绵粉蚧随机基因组序列中共分离出115,639个微卫星位点。发现2碱基重复(dinucleotide repeats，DNR)位点为5891(28.55％)个，3碱基重复(trinucleotide repeats，TNR)位点为9012(43.68％)个，4碱基重复(tetranucleotiderepeats，TTNR)位点为4904(23.77％)个，5碱基重复(pentanucleotide repeats，PNR)位点为764(3.70％)个，6碱基重复(hexanucleotide repeats，HNR)位点为61(0.30％)个(表2)。最丰富的碱基重复分别为AAT、AT、AAAT、AAC和AG(图1)。二碱基重复到六碱基重复的位点平均长度最小17bp，最大是54bp。频率和密度分别在0.18-26.7/Mb和9.9-522.907/Mb范围内。

表2扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis微卫星位点分布特征

微卫星引物开发与验证：适合引物设计的位点有28469个。本发明的引物设计时，每个位点可开发一对或多对引物，但是大多引物难以满足扩增效率和多态性的要求，初步筛选76对引物保留下来，经过8个个体对引物的初次筛选，27对引物多态性低，扩增效率低于75％的引物有9对(其中2对引物扩增效率和多态性均低)，共计42对引物被保留用于后续种群多态性验证。

选取3个种群，利用本发明开发的42对微卫星分子标记，分析3个扶桑绵粉蚧的种群多样性以及种群结构。利用本发明开发的42个微卫星位点分析所得数据分析扶桑绵粉蚧种群多样性。观测杂合度(Observed heterozygosity，H

扶绵粉蚧种群遗传结构分析：本发明基于开发的42对扶桑绵粉蚧微卫星位点，研究种群遗传结构。来自3个种群的72个个体分分成2个簇，分别是广东和江苏种群为一簇，江西种群为一簇。用DAPC分析，发现三个种群均独立分开。

以上结果表明，利用本发明开发的42对微卫星分子标记，对随机选取的3个扶桑绵粉蚧群体进行研究，阐明了3个扶桑绵粉蚧种群结构，并且位点的分辨率高，准确性好，说明本发明的微卫星分子标记具有较好的保守性及通用性。

表3-1

表3-2

表3-3

表3-4

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 用于鉴定扶桑绵粉蚧物种以及分析种群的遗传多样性与种群结构的SSR引物

<150> 2020108235439

<151> 2020-08-17

<160> 84

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgagttcgac tccgtgcatt 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagctgtcta tccgtaattc cg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgttcgtgg attgcttgcg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctttctaag cgcatttgga g 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttagaagga cgggtcggg 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttagaagga cgggtcggg 19

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggaaagtca tacgataccg aa 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctacacata actctgcagg ca 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caacacctcc ctaccgaacc 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgaactagaa tgtggatgtg cg 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gctacctatt tcctggccgc 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agaactgtcg tcaagaggtg a 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acatttgggt cctttcagcg a 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

actcgaaggg atggtttggc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgtgcaacga actcctacgt 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acaccttcac ccgaacaaag 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aattcgcagc gcctagtcat 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gttgcaggtt cgttacaggc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgctcctttg gaaacgactg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttcaccgaag aatgcgcaag 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cctatgctag tcgcgtatcc a 21

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgctggtatg cacaaatacg tg 22

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aattgcagca cacgcacaat 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tgcctcgcat ctcttagtgc 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tctgggctag aggcgaattt 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ggctttgtat gggagctggg 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tctcccgtcg ttgaacatgg 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cggaaactgc gcgtaataag g 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cctctgcctg ctcagttcat 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cggtttcagt ttaggagcgg 20

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

tctcacgctt atgacgtact cg 22

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gcgccagact acacctaacc 20

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

agcacaatca tcttgacagc tg 22

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cgacgtgtac gcaaagttga 20

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tgacgagaac tgaacgaatg gt 22

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ggtaacggca gccaacaatt 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

agaggatagc cgaatacgcg 20

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gccaaagttc gactcgtata ca 22

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gaagtgccag aggagccatt 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

atcatatcat cgccgccgtg 20

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

tatcgcttaa cgggtccgc 19

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

agtgcctgca tgtctagtgt 20

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

atgcatttag tggtaactgg ca 22

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

tatcttgagt gagccacgcc 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

cggcaaaggc agaacaactc 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gcgccggatc attcaggtaa 20

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

tgcggctgaa taaactgaca ac 22

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

gggcattcgc gttatactcg 20

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

gggcacgatc taaagagtcg a 21

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

cgcacacgtt actaggcaga 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

ggtacctagt cgttgcgcta 20

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

tgtactttaa ggtgcacttg cg 22

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

agtttaaagc gcacgagtga c 21

<210> 54

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

gggaaatcga cagccgct 18

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

gcgcgtgtaa ttctagcgat 20

<210> 56

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

accttcagca gttgacaatc tt 22

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

tcgcgtgtta ttatgccgga 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

tccagcttta cgtatcgcct 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

tgcgctgcta cttatgcaga 20

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

tcgtcgtggt cgtgtcttac 20

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

aaagtagtcc gcccgtcaag 20

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

cgcagtccga acacaattgc 20

<210> 63

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

cggtaacctg tgatcttgtg g 21

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

ccatcgatgc ggagaccaat 20

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

cgtaagcagt gatagcgcac 20

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

tgccatccca agcagaagtt 20

<210> 67

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

ccaacatcta tacccgcgta tt 22

<210> 68

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

acagccatac ttgcggtata ca 22

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

ggataaggcg acgtgctctt 20

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

atcgcgtatt cggaaagcga 20

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

atgactactg gccactgtgc 20

<210> 72

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

ctctggtagg gacttactac gt 22

<210> 73

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

tgaggtgata agaagctctt gc 22

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

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<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

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<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

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<211> 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 20

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<211> 20

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<210> 82

<211> 21

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<210> 83

<211> 20

<212> DNA

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gcgctagcct tctcaacgta 20

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

gcttccattg cccttccaac 20