基底膜及其主要成分-Ⅳ型胶原对表皮角质形成细胞分化的影响

摘要

目的：　　探讨正常皮肤与瘢痕皮肤在组织结构学与细胞学中的差异，分析差异产生的原因，发现瘢痕组织的分化状态可能是由于缺少正常基底膜所致。使用基底膜主要组成成分Ⅳ型胶原铺板离体培养表皮干细胞，分析其在增殖分化过程中与空白对照组表皮干细胞在生物学特性等方面的异同点，验证基底膜及其主要组成成分Ⅳ型胶原是否在抑制表皮干细胞分化过程中起重要作用。　　方法：　　采用HE染色法认识正常皮肤与瘢痕皮肤结构，基底膜六胺银染色法分析对比正常皮肤与瘢痕皮肤基底膜结构差异，组织间接免疫荧光法探寻正常皮肤与瘢痕中的表皮角质形成细胞定位，分析不同分化阶段的表皮角质形成细胞在正常皮肤与瘢痕皮肤中分布与迁移规律差异。采用改良的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法分离培养人ESCs，观察其形态及增值分化的特点，并进行细胞间接免疫荧光鉴定。同时，继续以Ⅳ型胶原铺板作为实验组，以不铺Ⅳ型胶原做为对照组，采用高钙离子浓度(1.5mM)培养基培养表皮干细胞，以高钙刺激时间长短不同制造不同分化程度细胞模型。用Western blot及RT-PCR技术研究表皮角质形成细胞在不同处理因素下的表型变化，探讨基底膜及其主要组成成分Ⅳ型胶原在表皮角质形成细胞分化“命运”中的影响作用。　　结果：　　在体研究中发现正常皮肤中角质形成细胞在从基底层经棘层和颗粒层到角质层的分化及向上迁移过程中，经历了有序的成熟模式，这一过程与基底膜的正常结构和功能密切相关。而瘢痕组织由于缺少了基底膜成分，细胞分化状态紊乱，提前进入分化过程。采用改良的Ⅳ型胶原差速黏附法能够高效的分离表皮中的干细胞，分选出的细胞具有干细胞的形态特点且表达CK19、β1整合素；在高钙离子浓度(1.5mM)培养基诱导培养下，两组细胞均随刺激时间延长体积变大，折光性变弱，核浆比变小，进而出现聚集分层现象，而经过同时长高钙离子培养基刺激的两组细胞，铺了Ⅳ型胶原的实验组细胞相较对照组体积小，细胞聚集及分层现象均出现较迟，形态学上更趋近于未分化特性。RT-PCR和Western-blot检测结果发现Ⅳ型胶原黏附培养表皮干细胞后，实验组细胞中CK19的表达较对照组增强，同时做为短暂扩充细胞标志的CK14以及作为终末分化细胞标志的CK10，在无Ⅳ型胶原铺板组中的表达明显高于胶原组，同样再次支持了Ⅳ型胶原抑制表皮细胞分化的现象。　　结论：　　ESCs并非真正静止的未分化细胞，而是一种已经进入分化状态但是仍具有多向分化潜能的干细胞，其增殖分化行为不但受到自身程序化基因表达的影响，同时又受到其所处的微环境-基底膜及其成分的调控。Ⅳ型胶原能够抑制表皮角质形成细胞在体外发生分化，保持干性的表皮干细胞具有较强大的分裂增殖能力，可以作为种子细胞应用于皮肤创伤修复与再生的相关研究之中。

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第一章正常皮肤与瘢痕皮肤在组织结构学与细胞学中的差异

前言

一、正常皮肤与瘢痕皮肤快速冰冻切片的苏木精-伊红染色（HE）

二、正常皮肤与瘢痕皮肤基底膜六胺银染色法

三、正常皮肤与瘢痕皮肤组织的间接免疫荧光染色

第二章 表皮干细胞的分离培养鉴定及Ⅳ型胶原对表皮干细胞增殖分化的影响

前言

一、表皮干细胞的分离培养鉴定

二、表皮干细胞体外培养及诱导分化体系建立

三、 荧光实时定量PCR（RT-PCR）

四、蛋白提取及免疫印迹分析

五、生长曲线绘制

讨论

一、基底膜在瘢痕和正常皮肤中的差异

二、表皮干细胞的特性及表面标志物

三、表皮干细胞的分离培养鉴定

四、钙离子对表皮细胞分化的影响

五、Ⅳ型胶原铺板体外培养表皮干细胞

结论

参考文献

文 献 综 述:表皮干细胞的生物学特性

缩 略 语 表

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