辽宁省MSM人群HIV感染者基因型耐药以及与流行毒株相关的社会网络特征研究

摘要

目的：　　 近年来,中国艾滋病的流行呈快速上升趋势,并且正从高危人群向一般人群传播。至2009年底,中国新发感染者中经同性性传播的比例已经从2007年的12.2%上升至32.5%。2011年卫生部评估报告显示,中国78万HIV感染者中,经同性传播占17.4%。MSM已成为我国HIM-1感染上升最快的人群。由于男男性行为(menwhohavesexwithmen,MSM)人群的多性伴、安全套使用率低、偶然性行为多等特征,使其成为HIV感染与传播的重点人群。已有研究对辽宁省MSM高危人群进行研究,2006年沈阳MSM的HIV感染率5.7%,2008年则升至8.7%。MSM人群已成为辽宁省艾滋病感染的重要目标人群。　　 2003年我国开始对达到抗病毒治疗标准的HIV-1感染者提供免费高效抗逆转录病毒治疗(HighlyActiveAnti-RetroviralTherapy,HAART),显著降低了艾滋病(AIDS)的发病率和死亡率。但在药物的选择压力下,HIM-1可能很快产生耐药突变而对药物产生抗性。2007年全国耐药监测结果显示,我国接受HAART。治疗人群中耐药突变率逐年升高,已达到17%。耐药突变株可在人群中广泛传播,导致后来的感染者在用药前已经对某药物的耐受。由于MSM人群中HIV感染者在近5年增长迅速,该人群的耐药发生率也可以从一定程度上反映我国HIV感染者中耐药株的传播情况。而新发急性感染者体内较高的病毒复制水平能够显著的增加HHIV的传播风险。对MSM人群中HIV-1新发急性感染者耐药突变发生情况进行研究,能直接反映耐药株传播的最新动向。　　 我国针对MSM人群丌展的主要研究大多数着眼于分子流行病学的研究,或者是针对个体的危险行为,而对MSM人群进行结合分子流行病学的社会关系网络结构的分析极少。本研究针对辽宁省MSM人群既往感染者以及新发急性感染者的耐药水平,以及该人群感染病毒株的流行情况进行研究,并以之为基础结合其人口学特征及行为学特征对其社会关系网络进行分析统计,从网络层面了解我省MSM人群HIV经不同途径传播的风险以及该人群中耐药株的传播情况。　　 方法：　　 1、研究对象　　 1.1.2005-2008年在本院艾滋病门诊随访的辽宁省165例MSMHIV/AIDS患者。纳入标准为:(1)自报在过去的6个月内与男性发生过口交和/或肛交性行为,(2)年龄≥18岁的男性。(3)提供书面知情同意。所有感染者均由本艾滋病确认实验室经蛋白印迹方法(WB)确认。采集血样时未接受任何抗艾滋病毒治疗。　　 1.2.2009年1月-2011年12月,在辽宁省建立了1934例MSM高危人群的丌放性前瞻性队列,随访发现新发急性感染者。新发急性感染者入选标准:①抗体ELJSA检测阴性,血浆HIV-1RNA检测阳性:②抗体ELISA检测阳性,WB检测结果为阴性或不确定;③6个月内HIV抗体阳转的患者。上述①和②均经随访证实血清WB检测达到HIV-1阳性诊断标准,满足以上任一条件且未经抗病毒药物治疗的感染者作为研究对象。所有接受采集样本者均签署知情同意书。　　 2、CD4+T淋巴细胞测定　　 20μlCD4/CD8/CD3TriTEST试剂加入TruCOUNT管中,加入50μl抗凝血,室温避光15min,加入免沈溶血素450μl,室温避光15min,用FACSMMLTISET软件检测并进行自动分析、计算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值及相应比值等。　　 3、病毒载量测定　　 以1ml血浆采用Roche公司COBASAmpliPrep/COBASTaqMan全自动化的实时荧光定量PCR系统测定病毒载量。检测范围为40-107copies/ml。　　 4、病毒核酸提取　　 以200μl血浆提取病毒基因组RNA,按照QIAampwholebloodMiniKit和QIAampViralRNAMiniKit说明书步骤提取DNA或RNA,提取物溶于100μl洗脱液中。　　 5、耐药株基因变异的测定　　 RNA逆转录PCR和套式PCR方法,以外侧引物对:MAW-26(5'-TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3'HIV-1HXB22027-2050nt)和RT-21(5'-CTGTATTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3'HIV-1HXB23509-3539nt);内侧引物对:Pro-1(5'-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3'HIV-1HXB22147-2166nt)和RT4R(5'-CTTCTGTATATCATTGACAGTCCAGCT-3'HIV-1HxB23300-3326nt)用于扩增HIV-1蛋白酶编码区1-99氨基酸和逆转录酶编码区1-240氨基酸。　　 6、PCR反应产物纯化　　 取终产物5μl进行1%琼脂糖凝胶电泳,经Ultra-VioletProduct凝胶成像后与marker比对,确认所需片段,用QIAquikGelExtractionKit试剂盒纯化基因片段。　　 7、PCR反应产物测序　　 将纯化后的PCR产物,以Pro-1(正向):CAGAGCCAACAGCCCCACCA,RT-A(正向):GTTGACTCAGATTGGTTGCAC,RT-B(正向):CCTAGTATAAACAATGAGACAC,ProC1-down(反向)5'CCCTGCTGGGTGTGGTATTCC3',RT4R(反向)CTTCTGTATATCATTGACAGTCCAGCT为测序引物进行测序反应。测序使用美国AppliedBiosystem公司的BigDyeTerminatorSequencing试剂盒和ABI377型DNA测序仪。　　 8、基因型耐药分析　　 以VectorNT1910软件中ContigExpress组件进行序列拼接,参照测序谱图进行基因序列修订后,将序列递交美国斯坦福大学HIV耐约数据库(http://hivdb.Stanford.edu/hiv/)在线分析耐药变异的位置和种类。　　 9、序列分析　　 经PCR扩增和测序得到HIV-1pol基因的基因序列片段,以VectorNTI软件包中ContigExpress组件进行序列拼接,然后将这些序列用Bioedit软件包中CLUSTALW程序进行序列排列比对,并在核苷酸序列中人工引入gaps保持翻译完整性。应用Bioedit软件处理原始核苷酸序列,参照测序谱图进行基因序列修订后,翻译为氨基酸序列。使mMega4.1软件中Neighbour-joining方法,对耐药队列的序列数据构建系统进化树,计算两个流行簇毒株的基因距离。　　 10、统计分析　　 使用EpiData3.0进行数据录入。采用SPSS17.0软件进行描述性分析、单因素Logistic回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。应用UCINET6.O社会网数据分析软件进行分析。应用NetDraw形成一维与二维数据分析图。　　 结果：　　 1、辽宁MSM人群HIV既往感染者与新发急性感染者流行病毒亚型分析　　 在MSM既往感染者中,HIV-1CRF01_AE亚型占89.8%(140/156),其次为B亚型占7.0%(11/156),最后为CRF07_BC亚型占3.2%(5/156)。在67例HIV-1新发急性感染者样品中,57例(85.0%)为CRF01_AE亚型,5例(7.5%)为B亚型,5例(7.5%)CRF07_BC亚型。　　 2、辽宁MSM人群HIV既往感染者与新发急性感染者感染毒株及主要流行簇比较分析　　 MSM人群新发急性感染者CRF01_AE及CRF07_BC亚型毒株与本地区MSM人群中既往感染者毒株混杂在一起,共同形成两支明显的CRF01_AE业型流行簇与一支CRF07_BC亚型流行簇。两组人群在CRF01_AE两支流行簇在MSM人群中依旧是已CRF01_AE亚型为主,第二簇占有绝对优辨。　　 3、辽宁MSM人群HIV既往感染者与新发急性感染者基因型耐药分析　　 MSM人群HIV既往感染者对任意一种药物发生耐药的突变频率达到3.2%,其中针对蛋白酶抑制剂(Proteaseinhibitor,PI)的耐药突变率为3.2%,主要发生在CRF01_AE亚型;而对于核苷类(nucleosideucleotidereversetranscriptaseinhibitor,NRTI)与非核苷类(non-nucleosidereversetranscriptaseinhibitor,NNRTI)的药物的耐药突变仅为0.6%,而针对这两种药物的耐药突变则均在B亚型感染者中出现。在新发急性感染者中耐药突变位点检测到4例(6.0%)存在针对PI的主要耐药突变位点,均发生在CRF01_AE亚型病毒感染者,未检测到针对核苷类与非核苷类药物的耐药突变。两组人群中携带相同耐药位点的样本遗传距离很近,聚集在一个流行簇内。　　 4、不同病毒亚型与毒株流行簇中感染者人口学因素与行为学因素特征　　 感染CRF01_AE亚型的感染者较其他亚型的感染者年龄偏大(p=0.040),主要集中在30岁以上;感染CRF01_AE亚型的感染者较其他亚型的感染者文化程度水平较低(p=0.047);所从事的也是一些收入水平较低的工作(p=0.040)。而在CRF01_AE亚型流行簇内分析,结果虽未达统计学差异,我们还发现一些有意义的变化趋势,如:发现流行簇Ⅱ中沈阳本地较多(p=0.075),从事低收入的工作较多(p=0.061);平均性伴数有多于流行簇Ⅰ的趋势(p=0.085);同性性行为持续时间有短于流行簇Ⅰ的趋势(p=0.059)。　　 5、MSM人群活动场所的社会网络特征　　 研究使用Johnson'sHierarchicalClustering聚类法将MSM社会活动网络大小聚为2类,其中一类以互联网为中心;另一类以非互联网中心。互联网,浴池和公共厕所/公园是MSM活动的主要的场所。CRF01_AE亚型感染者结识同性性伴的特征性场所,即公共厕所/公园;而互联网则足非CRF01_AE亚型感染肯的主要活动场所。携带耐药突变的感染肯主要通过互联网寻找同性性伴。　　 结论：　　 1.CRF01_AE亚型已成为辽宁省MSM人群既往感染者与新发急性感染者的主要病毒亚型,其中CRF01_AE毒株存在两个主要的流行簇,流行簇Ⅱ是我省MSM人群中CRF01_AE亚型中的优势毒株。B亚型与CRF07_BC亚型只占少数,CRF07_BC亚型形成另一流行簇。　　 2.在辽宁省MSM人群中HIV既往感染者总的耐药率为3.2%,对蛋白酶抑制剂耐药率为3.2%,对核苷类与非核苷类药物的耐药率均为0.6%。在新发急性感染者中的耐药率(6.0%)较既往感染者(3.2%)有所增加,应引起足够重视。　　 3.在辽宁省MSM既往感染者与新发急性感染者人群中,耐药突变主要是针对P1类药物,主要集中在CRF01_AE亚型毒株。　　 4.CRF01_AE亚型成为我省MSM人群HIV感染者的主要流行亚型,主要是由于该毒株在我省较底层次的社会人群之中的流行较快,他们具有收入水平较低,自我保护意识较差,而且同性性行为史较长等风险因素。　　 5.互联网,浴池和公共厕所/公园是MSM寻找同性性伴的主要场所。CRF01_AE亚型感染者结识同性伙伴的特征性场所主要是公共厕所/公园,而非CRF01_AE亚型感染者主要通过互联网寻找同性性伴。　　 6.感染耐药株的MSM新发急性感染者也是通过互联网寻找同性性伴。