耐热DNA聚合酶的定点诱变及应用于热启动PCR的纳米抗体的淘选

摘要

DNA聚合酶最初是在活生物体中DNA复制的基础分子生物学研究中被发现。众所周知，DNA聚合酶通过使用脱氧核苷三磷酸在DNA的复制过程中根据模板DNA合成新的DNA链。DNA聚合酶催化引物的3’-羟基末端和进入的三磷酸的磷酸基之间形成磷酸二酯键。目前，许多耐热DNA聚合酶被用于PCR以及参与核酸复制的其他程序，包括多重PCR，巢式PCR，反转录PCR和DNA测序。聚合酶也可用于掺入经过修饰了的核苷酸，包括那些标签、报告或向DNA产物发信号的核苷酸。这些允许从复杂的样品，包括血液，唾液，法医痕迹，和化石遗体中扩增核酸。特定聚合酶的选择取决于具体的需要，特别是对持续合成能力和保真度、起始的温度或接受非天然核苷酸类似物的能力。每个原始的和基因改造产生的聚合酶具有不同的特点。然而，适当聚合酶的合理选择取决于应用程序本身。本实验第一部分采用重叠延伸PCR方法介导的定点突变技术对高保真DNA聚合酶进行基因工程改造，并在大肠杆菌中得到高效表达，以期DNA聚合酶掺入核苷酸修饰底物（如脱氧核苷酸、双脱氧核苷酸、核糖核苷酸和无环核苷酸）的能力增强。用Taq DNA聚合酶单克隆抗体实现热启动PCR，能够减少引物错配、降低引物二聚体的形成和非特异性扩增的产生，从而增加PCR的特异性。本实验第二部分以DNA聚合酶为靶分子，从羊驼天然噬菌体文库中采用生物亲和淘选的方法获取DNA聚合酶纳米抗体，并结合分子克隆技术，表达和纯化酶抗体，目的是应用于热启动PCR，主要研究内容及结果如下：　　1.采用重叠延伸PCR介导的定点突变技术，对DNA聚合酶基因依次引入了六个突变，成功构建了四种重组质粒，分别是pET22b-polAD146AE148A、pET22b-polAD146AE148AA490L、pET22b-polAD146AE148A413LYP415SAV和pET22b-polAD146AE148A413 LYP415SAVA490L。　　2.在E.coli BL21(DE3)、E.coli Rosetta(DE3)plysS和E.coli BL21 CodonPlus(DE3)RIL三种宿主菌中选取E.coli BL21(DE3)作为表达菌，优化后的诱导表达条件为0.1mM IPTG在37℃下诱导3h。并且优化了重组DNA聚合酶PCR反应缓冲液组分：pH9.0、5mM(NH4)2SO4和1.5mM Mg2+。同时，重组DNA聚合酶具有很强的耐热性，95℃处理6h后仍有酶活。用Bradford法测定蛋白浓度，经梯度滴定法测得自制酶酶活为7.5U/μL，比活力为18293U/mg。　　3.以Taq DNA聚合酶为靶蛋白，采用固相淘选的方法，获得五个特异性结合的纳米抗体；以自制DNA聚合酶为靶蛋白，采用固相淘选的方法，获得五个特异性结合的纳米抗体。　　4.采用分子克隆技术，成功构建了pET25-T6、pET25-T19和pET25-S3三个原核表达载体，转化到E.coli Rosetta(DE3) plysS宿主菌中，经0.2mM IPTG诱导表达后，得到了可溶性的纳米抗体蛋白T6、T19、S3。ELISA鉴定表明，仅S3蛋白与自制酶有高亲和力，但不是结合在酶活性中心，因此不能应用于热启动PCR。

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第1章 综述

1.1 DNA聚合酶

1.2 热启动PCR

1.3 主要研究目的及意义

第2章 耐热DNA聚合酶基因的改造

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 小结

第3章 重组DNA聚合酶在大肠杆菌中的高效表达与纯化

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

3.5 小结

第4章 DNA聚合酶纳米抗体的淘选与鉴定

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

4.5 小结

第5章 DNA聚合酶纳米抗体的表达及活性鉴定

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 实验结果

5.4 讨论

5.5 小结

第6章 结论与展望

6.1 结论

6.2 进一步工作方向

致谢

参考文献

附录A 实验仪器

附录B 氨基酸基本信息表

攻读硕士学位期间的研究成果