硫化氢参与新生期结肠炎诱发成年大鼠慢性内脏痛的脊髓机制初步研究

摘要

目的：肠易激综合症（irritable bowel syndrome，IBS）临床表现为腹部疼痛不适，是一种常见的胃肠道疾病。至今，IBS的发病机理还尚未明确。已有研究结果显示硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）在内脏痛觉过敏的形成过程中发挥着重要作用。然而，内脏痛敏过程中H2S在脊髓中的作用还不清楚。本课题旨在探究H2S在新生期结肠炎症（neonatal colonic inflammation，NCI）模型鼠脊髓中如何参与内脏痛敏的形成。　　方法：⑴NCI模型的建立：挑选出生后10天Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，将2cm导管插入大鼠肛门，并向其肠道内注射0.2 ml的0.5％冰醋酸（AA）从而诱导成年大鼠慢性内脏痛过敏模型。⑵腹部撤回反射评分（abdominal wall reconstruction，AWR score）：待大鼠6周龄时，通过结直肠扩张（colorectal distention，CRD）的方法比较对照组（CON）、NCI大鼠及注射药物后大鼠的痛行为。⑶蛋白质免疫印迹（Western Blot）：提取6周大鼠的胸腰椎段与T13-L2背根神经节（Dorsal root ganglion，DRG）相连接的脊髓背角，对其进行蛋白定量分析，检测 NCI模型大鼠脊髓背角内源性 H2S的合成酶胱硫醚β合成酶（cystathionineβ-synthetase，CBS）的表达。⑷脊髓切片膜片钳技术：记录 CON、NCI以及给药处理后的脊髓胶状质（substantia gelatinosa，SG）的突触传递及其神经元的兴奋性。　　结果：①新生大鼠肠道注射0.5%冰醋酸，成年后测量其对CRD的反应，结果显示NCI模型大鼠的AWR评分显著高于CON组，提示大鼠产生内脏痛觉高敏。②NCI大鼠脊髓背角SG区神经元兴奋性增加。表现在其发放动作电位（action potential，AP）的频率在40 pA、80 pA和120 pA电流刺激下显著增加，动作电位阈值（AP threshold）超极化和基强度（rheobase）显著降低，而静息膜电位（resting membrane potential）没有变化。③NCI大鼠可增强SG自发的兴奋性突触传递。利用脊髓切片膜片钳技术测定SG中自发兴奋性突触后电流（spontaneous excitatory post-synaptic currents，sEPSCs）的变化，结果显示NCI大鼠SG中sEPSC的频率显著升高，但幅度没有明显变化。④用Western Blot方法检测6周大鼠T13-L2段脊髓背角CBS的表达，发现与CON组相比NCI可显著上调CBS的表达。与行为结果相一致：NCI大鼠6周时，其AWR评分高于CON组，表现为大鼠内脏痛觉高敏。CSE表达则无明显改变。⑤给正常大鼠脊髓切片孵育NaHS（2.5μM）可增强sEPSC的频率，其幅度没有明显变化。⑥正常大鼠脊髓切片孵育TTX（1.0μM）后再灌流NaHS（2.5μM）记录微小兴奋性突触后电流（miniature excitatory post-synaptic currents，mEPSCs）。结果显示孵育NaHS后mEPSC频率显著升高，幅度没有明显差异。提示NaHS通过突触前机制发挥作用。⑦连续7天给予正常大鼠鞘内注射NaHS（2.5μM）后，可诱导大鼠产生内脏高敏。模拟NCI大鼠脊髓背角CBS上调引起的内脏痛敏。⑧连续7天给予NCI模型大鼠鞘内注射AOAA（10μg/kg）后，可显著降低NCI大鼠的内脏高敏反应，提示CBS-H2S参与NCI大鼠的内脏痛敏。⑨连续7天给予NCI模型大鼠鞘内注射AOAA（10μg/kg）后，可减弱NCI大鼠脊髓背角SG神经元的兴奋性突触传递，提示CBS-H2S可在脊髓背角水平发挥作用参与调节内脏痛。　　结论：新生期结肠炎导致成年大鼠脊髓背角神经元兴奋性增加和突触传递增强，脊髓背角 CBS表达的上调可能参与了突触传递增强和成年 NCI大鼠的内脏高敏；CBS-H2S信号系统可能主要通过突触前机制增加脊髓背角 SG中细胞的兴奋性突触传递及SG神经元的兴奋性。本研究揭示了脊髓背角中的CBS-H2S信号在NCI成年大鼠内脏痛敏形成中的作用，为治疗IBS患者的慢性内脏痛提供了一个潜在靶点。

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第一章 引 言

第二章 材料与方法

2.1 实验对象

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器设备

2.4 主要溶液配制

2.5 新生期结肠炎症（neonatal colonic inflammation, NCI）大鼠模型的建立

2.6 肠道动力学反应的行为学测试

2.7 脊髓冠状切片的制备

2.8 脊髓切片膜片钳记录

2.9 Western Blotting检测蛋白表达

2.10 统计学处理

第三章 实验结果

3.1 NCI大鼠AWR评分显著升高

3.2 NCI提高脊髓背角SG神经元的兴奋性

3.3 NCI增强SG区自发兴奋性突触传递

3.4 NCI大鼠脊髓背角CBS表达水平升高

3.5 NaHS对正常大鼠SG区sEPSCs的影响

3.6 NaHS作用的突触前机制

3.7 鞘内注射NaHS可使正常大鼠产生内脏痛觉高敏

3.8 AOAA翻转NCI引起的内脏高敏

3.9 AOAA翻转NCI引起的兴奋性突触传递增加

第四章 讨 论

参考文献

综述:H2S在外周及中枢神经系统中的作用

攻读硕士学位期间公开发表的论文与会议摘要

致谢